Изучение структурных и функциональных нарушений Х-хромосомы, приводящих к различным формам Х-сцепленной умственной отсталости Стрельников, Владимир Викторович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Умственная отсталость (УО) -

распространённое патологическое состояние, встречающееся в популяции с частотой около 3%. Более 50% случаев УО обусловлено генетически, причём значительная часть сцеплена с полом. К Х-сцепленным формам относятся, в частности, синдром Мартина-Белл (СМБ; наиболее распространённая наследственная причина УО; частота 1:2000-1:4000), умственная отсталость, сцепленная с хромосомной ломкостью в участке FRAXE (УО FRAXE, частота 1:50000), численные аномалии Х-хромосомы. Не исключено, что экспансия тринуклеотидного повтора в области ломкого хромосомного участка FRAXF также приводит к фенотипу УО.

Причинами СМБ и УО FRAXE является экспансия тринуклеотидных повторов (CGG)n в промоторных областях генов FMR1 и FMR2. Экспансия тринуклеотидных повторов - особый класс патогенных мутаций, известный с 1991г. Механизмы возникновения такого рода мутаций изучены недостаточно. Исследование мутационных процессов в области расположения генов FMR1 и FMR2 является как фундаментальной проблемой, способствующей пониманию закономерностей экспансии тринуклеотидных повторов вообще, так и социально значимой задачей по диагностике, профилактике, скринингу СМБ и УО FRAXE.

Эффективных средств для лечения больных с СМБ и УО FRAXE не существует, поэтому особую значимость приобретают выявление больных и медико-генетическое консультирование родственников. Очевидна также необходимость разработки эффективного протокола скрининга, который позволит снизить распространённость генетических форм УО в популяции. Неонатальный скрининг мальчиков на СМБ, УО FRAXE и численные аномалии Х-хромосомы позволит не только снизить частоту ряда форм УО, но и своевременно оказывать медицинскую и психологическую помощь больным с этими поздно выявляемыми заболеваниями.

Коротко актуальность проблемы можно сформулировать следующим образом:

1. Х-сцепленная умственная отсталость - распространённое
патологическое состояние с высокой частотой семейных случаев, что создает
предпосылки для эффективной профилактики.

1. Причины мутаций, приводящих к наиболее распространённым X-сцепленньгм формам УО, изучены недостаточно, а существующие методы лабораторной диагностики несовершенны, дорогостоящи и не могут быть использованы для широкого скрининга.

2. Молекулярная диагностика мутаций, приводящих к Х-сцепленным формам УО, в настоящее время в отечественной лабораторной практике используется недостаточно и малоэффективно.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы является разработка протоколов диагностики и скрининга распространённых форм Х-

сцепленной умственной отсталости на основе изучения структурных и функциональных изменений Х-хромосомы, приводящих к фенотипу УО. Задачами исследования являются:

1. Провести комплексный анализ области расположения генов FMR1, FMR2 и ломкого хромосомного участка FRAXF в районе хромосомы X(q27-q28), включающий: а) блот-гибридизационный анализ с использованием внугригенных ДНК-маркеров; б) анализ метилирования CpG-островков генов FMR1, FMR2 и ломкого участка FRAXF; в) изучение нормального микросателлитного окружения области FRAXA-FRAXF.

2. Изучить распределение аллелей динуклеотидных полиморфизмов DXS548, FRAXAC1, FRAXAC2, DXS1691, DXS1123, DXS1113 в контингенте нормальных индивидов и в группе больных с СМБ.

3. Определить границы и охарактеризовать свойства области
мейотической нестабильности микросателлитов при СМБ в рамках изучения
причин экспансии тринуклеотидного повтора (CGG)n в гене FMR1.

4. Разработать методы анализа метилирования CpG-островков, лежащих в области ломких хромосомных участков FRAXA, FRAXE и FRAXF для диагностики и скрининга СМБ, УО FRAXE, полных мутаций экспансии в FRAXF и численных аномалий Х-хромосомы.

5. Разработать протоколы диагностики и скрининга распространённых форм Х-сцепленной умственной отсталости на основе сравнительного анализа существующих и вновь разработанных методик.

Научная новизна. Впервые для обследования большой выборки больных с умственной отсталостью, составляющей 470 пациентов, одновременно применены различные методы лабораторной диагностики X-сцепленных форм УО, что позволило сделать выводы о характере структурных и функциональных изменений Х-хромосомы, приводящих к развитию фенотипов УО. Впервые в России определены популяционные характеристики полиморфных микросателлитных маркёров DXS548, FRAXAC1, FRAXAC2, DXS1691, DXS1123 и DXS1113 и возможность их использования в косвенной диагностике СМБ и УО FRAXE. Впервые описаны мутации DXS548, FRAXAC1 и DXS1123, свидетельствующие о мейотической нестабильности микросателлитов в семьях с СМБ. Разработаны и апробированы методики анализа функционального состояния генов FMRJ и FMR2 на основе метилчувствительной ПЦР. Модифицирован протокол диагностики СМБ. Впервые в России проведена успешная молекулярная диагностика УО FRAXE. Исследован характер метилирования CpG-динуклеотидов в промоторной области гена FMR2. Разработан метод анализа метилирования CpG-островков FRAXA, FRAXE и FRAXF в одной пробирке, предназначенный для выявления больных с СМБ, УО FRAXE, полных мутаций экспансии FRAXF и числовыми аномалиями Х-хромосомы при неонатальном скрининге мальчиков. Предложен алгоритм неонатального скрининга. На основе комплексного анализа области расположения генов FMR1, FMR2 и ломкого хромосомного участка FRAXF в

районе хромосомы X(q27-q28) предложена современная гипотеза этиологии экспансии тринуклеотидных повторов.

Практическая значимость работы. Проведена ДНК-диагностика у 470 больных с УО и у 49 родственников. Осуществлено 9 пренатальних диагностик СМБ в 8 семьях; в 5 случаях поставлен диагноз СМБ. В результате выполненного исследования разработаны подходы для молекулярно-биологической диагностики СМБ, УО FRAXE и полных мутаций экспансии FRAXF у больных с умственной отсталостью и диагностики носительства у родственников. Проведен дизайн олигонуклеотидных праймеров для анализа метилирования CpG-островков FRAXA, FRAXE и FRAXF. Разработан протокол неонатального скрининга мальчиков для выявления больных с СМБ, УО FRAXE, полных мутаций экспансии FRAXF и численными аномалиями Х-хромосомы. Социально-экономическая значимость результатов исследования связана с повышением эффективности лабораторной диагностики, пренатальной диагностикой, ранней диагностикой, скринингом и профилактикой Х-сцепленной УО.

Положения, выносимые па защиту.

1. Проведён комплексный молекулярно-генетический анализ области расположения генов FMR1, FMR2 и ломкого хромосомного участка FRAXF в районе хромосомы X(q27-q28) в норме и у больных с СМБ, УО FRAXE, численными аномалиями Х-хромосомы у мужчин с УО.

2. Разработаны протоколы лабораторной диагностики СМБ, УО FRAXE и метод диагностики полных мутаций экспансии FRAXF.

3. Определены популяционные характеристики динуклеотидных
полиморфизмов DXS548, FRAXAC1, FRAXAC2, DXS169I, DXS1123 и
DXS1113 в норме и у больных с СМБ в России. Описаны мутации маркёров
DXS548, FRAXAC1 и DXS1123, свидетельствующие о мейотической
нестабильности микросателлитов в семьях с СМБ.

4. Предложен алгоритм скрининга для выявления больных с СМБ, УО
FRAXE, полными мутациями экспансии FRAXF и численными аномалиями
Х-хромосомы.

5. Предложена и обоснована гипотеза нестабильности
микросателлитных повторов в области отсроченной репликации на X(q27.3-
q28).

Апробация работы. Материалы исследования докладывались на международных конференциях: на 30-й Европейской ежегодной конференциии по генетике человека (Лиссабон, 1998), на 11-й и 12-й ежегодных конференциях общества генетики человека Германии (Нюрнберг, 1999; Любек, 2000); на 2-й европейской цитогенетической конференции (Вена, 1999), на международной конференции «Геном человека» (Ванкувер, 2000); на 1-ой Всероссийской конференции "Медико-генетическое консультирование в профилактике наследственных болезней" в 1997, на конференциях ГНТП «Геном человека» в 1998 и 1999 гг. и межлабораторных семинарах МГНЦ РАМН.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 138 ссылок. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 22 рисунками.