Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 22
1.1. Элементы генома вирусного происхождения и их роль в процессе онкогенеза 22
1.2. Таксономия ретровирусов 28
1.2.1. Репликативный цикл ретровируса типа D Мейзона- Пфайзера 29
1.2.2. Организация генома вируса Мейзона-Пфайзера 33
1.2.3. Ассоциация вируса Мейзона-Пфайзера с патологией человека 40
1.3. Вирус Эпштейна-Барр 44
1.3.1. Геном вируса Эпштейна-Барр 45
1.3.2. Полиморфизм генома ВЭБ 46
1.3.3. Гены литической инфекции ВЭБ 48
1.3.4. Гены латентной инфекции ВЭБ 49
1.3.5. Трансформирующая функция белков латентной инфекции ВЭБ 52
1.3.6. Строение и функции белка EBNA-3C 54
1.3.7. Ассоциация ВЭБ с развитием злокачественных заболеваний 57
1.4. Вирусы папиллом человека 60
1.4.1. Организация генома ВПЧ 62
1.4.2. Патогенез ВПЧ 63
1.4.3. Роль ВПЧ в развитии онкологических заболеваний органов мочеполовой системы 66
1.5. Генетическая предрасположенность к развитию онкологических заболеваний 69
1.6. Роль генетических факторов в развитии поздних гестозов беременных 73
1.7. Молекулы клеточной адгезии 76
1.7.1. Структурная модель интегринов 77
1.7.2. Интегриныи сигналинг 80
1.7.3. Гликопротеиновый комплекс GPIIb-GPIIIa Полиморфизм аллоантигенной системы тромбоцитов РЦА) 82
1.7.4. Роль гликопротеинового комплекса GPIIb-GPIIIa в развитии атеросклероза 85
1.7.5. Роль интегринов в эмбриогенезе 86
1.7.6. Роль интегринов в развитии опухолей 88
1.8. Гены системы метаболизма этанола 93
1.8.1. Популяционные различия полиморфизма генов системы метаболизма этанола 96
1.8.2. Полиморфизм ферментов метаболизма этанола и риск развития алкогольной патологии 99
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 104
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение. 138
3.1. Исследование элементов генома вирусного происхождения. 138
3.1.1. Детекция ДНК вируса Эпштейн-Барр в клетках периферической крови методом ПЦР . 138
3.1.2. Полиморфный элемент гена EBNA-3C вируса Эпштейн-Барр 144
3.2. Интеграция ретровируса типа D Мейзона - Пфайзера в хромосомы человека 153
3.2.1. Амплификация методом селективной ПЦР- супрессии концевых участков вирусной ДНК и прилегающих участков ДНК человека 153
3.2.2. Гибридизация по Саузерну продуктов ПНР, содержащих концевые участки вирусной ДНК и прилегающие участки ДНК человека 157
3.2.3. Создание библиотеки клонов 159
3.2.4. Скрининг бибилиотеки и селекция клонов, содержащих концевые участки вирусной ДНК и
прилегающие участки генома человека 160
3.2.5. Анализ нуклеотидной последовательности вставки рекомбинантного клона 51 164
3.2.6. Подтверждение наличия LTR вируса Мейзона-
Пфайзера в 17-ой хромосоме человека 166
3.2.7. Анализ сайтов интеграции последовательностей вируса Мейзона-Пфайзера в хромосомы человека 171
3.2.8. Характеристика участков разрывов LTR вируса 174
3.2.9. Функциональная характеристика участков генома человека, в которые произошла интеграция MPMV 176
3.2.10. Обсуждение результатов раздела 3.2. 179
3.3. Детекция элементов генома вируса папилломы человека типа 16 в клетках опухолей и периферической крови пациентов, страдающих раком мочевого пузыря. 183
3.3.1. Анализ ДНК, выделенной из клеток 183
периферической крови пациентов с первичными опухолями органов мочеполовой системы, методом ПТТР.
3.3.2. Исследование биопсийных препаратов опухолей мочевого пузыря методом гибридизации in situ. 186
3.4. Исследования элементов генома клеточного происхождения 191
3.4.1. Идентификация аллелей PLA1 и PLA2 гена GP3a в генотипе пациентов 191
3.4.2. Первичный скрининг распределения генотипов гена GP3A среди пациентов с урогенитальными злокачественными опухолями 196
3.4.3. Анализ и оценка достоверности различий аллельного распределение гена GP3A у больных раком предстательной железы, группы контроля и в популяции 201
3.4.4. Анализ и оценка достоверности различий аллельного распределение гена GP3A у больных РПЖ в
зависимости от стадии заболевания 204
3.4.5. Анализ и оценка достоверности различий аллельного распределение гена GP3A у больных раком предстательной железы в зависимости от степени дифференцировки опухоли 207
3.4.6. Анализ и оценка достоверности различий аллельного распределение гена GP3 А у больных раком предстательной железы в зависимости от группы риска 212
3.5. Аллельное распределение гена GP3A в группах беременных женщин с гестозами и фетоплацентарной недостаточностью, контроля и в популяции . 216
3.5.1. Анализ распределения аллеля PLA2 в группах пациенток с разными сочетаниями диагнозов гестоза и/или патологии ФПС.
3.5.2. Анализ распределения аллелей PLA1 и PLA2 в разных группах беременных с гестозами и патологией ФПС. 220
3.5.3. Роль генотипов матери и плода в прогнозировании развития позднего гестоза и патологии фетоплацентарной системы 224
3.6. Исследование роли полиморфизма алкогольдегидрогеназы-2 в развитии алкогольной патологии в московской популяции 232
3.6.1. Анализ полиморфизма АДГ2 у лиц с алкогольной патологией 232
3.6.2. Роль полиморфизма АДГ2 в развитии алкогольного цирроза печени в зависимости от инфицирования вирусами гепатитов В и С. 236
Выводы. 247
Список литературы
- Элементы генома вирусного происхождения и их роль в процессе онкогенеза
- Детекция ДНК вируса Эпштейн-Барр в клетках периферической крови методом ПЦР
- Анализ сайтов интеграции последовательностей вируса Мейзона-Пфайзера в хромосомы человека
- Аллельное распределение гена GP3A в группах беременных женщин с гестозами и фетоплацентарной недостаточностью, контроля и в популяции
Введение к работе
Актуальность проблемы. Элементы генома человека представлены нуклеотидными последовательностями ДНК клеточного и вирусного происхождения. Несмотря на успешное завершение международного проекта «Геном Человека» (2001) полной расшифровкой нуклеотидной последовательности генома человека, функциональное значение большей части его элементов остается неизвестным [384].
Некоторые элементы генома человека как клеточного, так и вирусного происхождения могут рассматриваться в качестве маркеров основных групп генетически детерминируемых болезней человека. Такое определение функциональной значимости элементов генома человека способствует более глубокому пониманию механизмов патогенеза заболеваний, улучшению качества дифференциальной диагностики, обоснованию методов лечения и созданию новых направлений в терапии заболеваний с наследственным предрасположением.
Известно, что сбалансированный полиморфизм участков генома определяет целый спектр наследственных болезней человека, а также индивидуальные и популяционные различия наследственной предрасположенности к генетически детерминируемым болезням. С этой точки зрения полиморфные локусы являются генетическими маркерами, адекватный выбор которых позволяет решать как фундаментальные, так и прикладные медико-биологические задачи.
Генетические маркеры обладают большим диагностическим и прогностическим потенциалом, т.к. остаются неизменными на протяжении всего онтогенеза и не зависят от наличия или отсутствия патологического процесса в организме. Они могут с успехом использоваться для оценки эффективности лечения и прогноза исхода болезни, а также для скрининга
населения и формирования групп риска развития генетически детерминируемой патологии.
Актуальность темы определятся основополагающей ролью генетических элементов в развитии заболеваний с наследственным предрасположением. Причины и механизмы развития этих болезней остаются недостаточно изученными, поскольку эти заболевания не имеют единой молекулярной основы, а их развитие связано с провоцирующим действием эндогеннных и экзогенных факторов [12]. В то же время, медико-генетическая служба в России не располагает компьютеризированными федеральными и региональными регистрами генетических маркеров болезней с наследственным предрасположением, а число реально диагностируемых молекулярными методами наследственных болезней в России не превышает 20 [13].
В настоящее время известно, что формирование злокачественных опухолей человека индуцируется онкогенными вирусами или фрагментами генома. В ряде случаев описана интеграция ДНК онкогенных вирусов в хромосомы человека, что является необходимой стадией канцерогенеза [22, 453]. Интеграция ДНК ретровирусов (провирус) в геном человека может влиять на регуляцию экспрессии генов, контролирующих пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток, поскольку LTR ретровирусов представляют блок регуляторных элементов, включающий промоторные и энхансерные последовательности, а также участки сплайсинга и полиаденилирования.
В связи с этим, изучение молекулярных основ вирусного онкогенза, связанных с интегрированными онковирусными последовательностями, является приоритетным направлением медико-биологических исследований, а мониторинг вирусной инфекции является необходимой профилактической мерой в клинике опухолевых и аутоиммунных заболеваний [10, 19].
Необходимость прогнозирования течения онкологического заболевания, которое связано с проблемой последующего рецидива опухолевого роста, ставит перед клиницистами также задачу регистрации специфических генетических маркеров клеточного происхождения [24]. Одним из современных исследовательских направлений является изучение роли молекул клеточной адгезии в процессе канцерогенеза. С этой точки зрения несомненный интерес представляют интегрины, которые не только выполняют рецепторную функцию, но опосредуют влияние экстрацеллюлярного матрикса на экспрессию генов, движение, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.
Полиморфизм ЬеиЗЗРго рЗ-субъединицы интегринового рецептора, является одним из факторов развития различных опухолей у человека. В настоящее время установлена непосредственная корреляция между наличием аллеля PLA2 гена GPIIIa (ITGB3) в генотипе пациента и развитием раков кожи, молочной железы и яичников, что имеет большое значение для клинического прогнозирования прогрессии опухолевого роста и определения групп риска [85].
Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению стадий канцерогенеза, связанных с полиморфизмом интегриновых рецепторов, проявления данной корреляции в каждом конкретном типе опухоли остается непонятным, что определяет актуальность современных исследований в этом направлении [43, 213, 403]. В настоящее время остается малоизученной корреляция аллеля PLA2 гена GPIIIa с опухолями органов мочеполовой системы, в том числе рака мочевого пузыря (РМП) и рака предстательной железы (РПЖ), а также роль аллеля PLA2 в развитии и прогрессии опухолей, связанных с генетическими изменениями РЗ-субъединицы интегринов.
Одним из основных направлений снижения перинатальной заболеваемости и смертности является выявление информативных
генетических маркеров, контролирующих особенности течения гестационного процесса и обеспечивающих раннее выявление осложнений беременности, среди которых гестоз занимает ведущее место в структуре материнской и детской смертности [2, 12].
В структуре патологии перинатального периода высокий удельный вес имеет недостаточность фетоплацентарной системы (ФПС) и её наиболее значимое клиническое проявление в виде задержки развития плода (ЗРП), частота которой колеблется от 3% до 40% [44, 52]. Раннее выявление данной патологии необходимо для ее успешной коррекции, однако, доклиническая диагностика как ЗРП, так и позднего гестоза не разработана. Широко применяемая ультразвуковая фетометрия плода не пригодна для доклинической диагностики недостаточности плаценты [12].
Известно, что ведущими звеньями патогенеза гестоза и ЗРП являются нарушения сосудистого компонента и межклеточных контактов между тканями матери и плода при формировании плаценты [248, 447, 448]. На доимплантационной стадии ключевую роль в формировании контактов между эмбрионом и эндометрием играют цитокины, факторы роста и интегрины, влияя на процессы имплантации и васкуляризации трофобаста, при нарушении которых возникает ранняя плацентарная недостаточность и, как следствие, ЗРП [449].
В последнее время установлено, что в результате мутаций соответствующих генов нарушается структура молекул адгезии клеток цитотрофобласта и материнских тканей, необходимых для нормального процесса инвазии. Наличие аллеля PLA2 связывают с процессами венозного и артериального тромбоза, а также с нарушениями имплантации' и ограничением инвазии трофобласта повехностными слоями [42, 448].
Нам представляется вполне вероятным, что носительство аллеля PLA2 определяет предрасположенность к локальному сосудистому тромбозу с последующим развитием фетоплацентарной недостаточности и задержки
развития плода, несмотря на отсутствие сведений по этому вопросу в современной литературе.
Интенсивная алкоголизация населения является одной из основных медико-социальных проблем в России, связанных с общественным здоровьем нации и процессами депопуляции. Высокий уровень потребления спиртного, по некоторым оценкам превышающий 14 литров абсолютного алкоголя на человека в год, привел к резкому увеличению негативных исходов алкоголизации, в том числе росту уровня заболеваемости и смертности по причинам, связанным с злоупотреблением алкоголем среди населения [15, 30, 36, 38].
Анализ колебаний смертности показал, что российская популяция реагирует на колебания уровня потребления алкоголя четырехкратным повышением показателя общей смертности, по сравнению с населением западных стран. Частота хронческих заболеваний печени на 100 тыс. населения в Россиской Федерации в 2-3 раза выше, а смертельных отравлений алкоголем в 4-5 раза выше по сравнению с европейскими странами, сопоставимыми с Россией по уровню потребления алкоголя [16, 299].
Для российской популяции характерен наиболее опасный для здоровья населения паттерн потребления - северный, с преимущественным потреблением крепкого алкоголя, сопровождаемым тяжелой интоксикацией и девиантным поведением. Однако, по данным опроса 1999 года, уровень потребления спиртного, частота и разовая доза потребления, уровень тяжелой интоксикации среди населения российской популяции значительно превышают аналогичные показатели других северных стран: Финляндии, Швеции, Норвегии [8, 15].
Известно, что индивидуальные и популяционные различия потребеления алкоголя определяются как этническими и социокультурными особенностями, так и генетическими факторами [139, 322]. В решающей степени эти различия определяются активностью ферментов системы
метаболизма алкоголя и, в первую очередь, фермента первого этапа окисления этанола - алкогольдегидрогеназы типа 2 (АДГ2) [54, 87, 88, 89].
Аллельный вариант АДГ2-2 контролирует синтез высокоактивной АДГ2, которая обеспечивает быстрое накопление токсичного альдегида в тканях, независимо от наличия или отсутствия неактивной изоформы фермента второго этапа метаболизма этанола - альдегиддегидрогенеазы типа 2 (АлДГ2-2). Известно, что аллель АДГ2-2 широко распространен в монголоидных популяциях (частота составляет 35-80%), где он является протективным генетическим фактором потребления значительных доз спиртных напитков, и крайне редко встречается в европейских популяциях (0-5%) [181, 183, 197 ].
Население авропейской части России традиционно принято относить к европейским популяциям. Однако, особенности потребления алкоголя в России ставят вопрос о возможности популяционных особенностей в системе генов метаболизма алкоголя, влияющих на избыточную заболеваемость и смертность россиян, что определяет необходимость молекулярно-генетических исследований по изучению полиморфизма генов системы метаболизма алкоголя в российской популяции.
Сложившиеся в мировой науке оценки медико-демографической ситуации в России ставят вопрос о приоритетных направлениях исследований для медико-биологических наук. Согласно данным ВОЗ рождаемость в РФ снизилась на 31,1%, а отрицательный прирост населения составил 1,9%. В структуре смертности населения России онкологические заболевания занимают третье место после сердечно-сосудистых заболеваний (55,5%) и отравлений и травм (14,5%) [16, 44].
В связи с этим, особую актуальность приобретают научные исследования, связанные, в первую очередь, с изучением молекулярно-генетических основ репродуктивного и психического здоровья населения. Выявление генетических маркеров наиболее распространенных и социально
значимых заболеваний, в том числе онкологических, болезней матери и плода, соматических и психических нарушений, развивающиеся на фоне хронической алкогольной интоксикации у злоупотребляющих алкоголем лиц, не вызывает сомнения.
Исследования в этом направлении являются крайне актуальными как для клинических, диагностических и прогностических целей, так и для проведения широкомасштабного скрининга населения с целью формирования групп риска развития генетически детерминируемой патологии и проведения досимптоматической терапии.
Цель исследования. Идентификация новых информативных генетических маркеров для основных групп заболеваний с наследственной предрасположенностью на основе молекулярно-генетического анализа элементов генома человека клеточного и вирусного происхождения. Для достижения указанной цели были сформулированы следующие основные задачи:
Изучить высоковариабельный участок гена EBNA-3C вируса Эпштейна-Барр с целью определения прогностического значения полиморфного участка генома ВЭБ в определении моно- и поликлонального характера инфицирования В-лимфоцитов.
Провести молекулярно-генетический анализ участков генома вируса Мейзона-Пфайзера (MPMV), интегрированного в хромосомы больных с В-клеточными Беркитт-подобными лимфомами, и охарактеризовать их функциональную значимость в контексте схемы вирусного онкогенеза.
Изучить корреляцию ВПЧ-инфекции с риском развития онкологических заболеваний органов мочеполовой системы на основе регистрации элементов генома вируса папилломы человека типа 16 (HPV-16) в клетках опухолей и в циркулирующих клетках
периферической крови пациентов методом ПЦР и гибридизации in situ.
Изучить роль полиморфизма ЬеиЗЗРго гена гликопротеина GPIIIa в развитии злокачественных новообразований органов мочеполовой системы.
Установить прогностическую значимость аллельного распределения гена GPIIIa в развитии и прогрессии рака предстательной железы (РПЖ).
Изучить корреляцию аллеля PLA2 гена GPIIIa с риском развития нарушений состояния фетоплацентарной системы для прогнозирования рождения детей с малым весом при разных формах позднего гестоза.
Изучить влияние генотипов гена GPIIIa матери и плода на развитие гестоза, фетоплацентарной недостаточности и задержки развития плода.
Изучить корреляцию аллельных вариантов АДГ2-1 и АДГ2-2 гена системы метаболизма алкоголя АДГ2 с риском развития разных форм клинического проявления хронической алкогольной интоксикации у злоупотребляющих алкоголем лиц.
Определить относительную роль генотипа АДГ2 и вирусной инфекции в развитии цирроза печени на фоне хронической алкогольной интоксикации.
Научная новизна работы. В результате молекулярно-генетических исследований элементов генома человека обнаружены новые информативные генетические маркеры вирусного и клеточного происхождения, определяющие развитие основных групп болезней с наследственной предрасположенностью.
Выявленный впервые полиморфизм участка гена EBNA-3C вируса Эпштейна-Барр позволяет регистрировать моно- и поликлональный характер
инфицирования В-лимфоцитов у пациентов с В-клеточными лимфомами. Впервые продемонстрирована интеграция полной копии ретровируса типа D Мейзона-Пфайзера в 10 и 17 хромосомы больных В-клеточными лимфомами, определен сайт его интеграции в локусе 17q. 11.22 и дана функциональная характеристика участка интеграции. Показано, что интеграция вируса Мейзона-Пфайзера произошла в непосредственной близости от экзона гена НСА-66, ассоциированого с гепатоцеллюлярной карциномой, характер интеграции соответствует схеме вирусного онкогенеза.
Впервые применен комплексный подход в определении генетических маркеров развития рака мочевого пузыря (РМП), включающий изучение генотипа пациента и инфицирование вирусом папилломы человека типа 16 (ВПЧ-16). Установлено, что инфицирование ВПЧ-16 является фактором риска развития РМП, аллельный вариант PLA2 гена гликопротеина GP3a увеличивает риск развития данного заболевания у носителей в 9,5 раза. В работе применен новый патентованный способ определения аллельных вариантов гена GP3a для оценки генетической предрасположенности к раку предстательной железы (РПЖ). Впервые установлены положительные корреляционные зависимости между генотипом PLA1PLA2 и риском развития РПЖ, а также степенью его инвазивности и метастазирования.
В работе впервые обобщены результаты молекулярно-генетических исследований роли полиморфизма гена GP3a в развитии нарушений состояния фетоплацентарной системы (ФПС) и задержки развития плода (ЗРП) у беременных женщин с гестозами. Впервые показано, что носительство аллеля PLA2 является 100% фактором риска развития недостаточности ФПС на фоне предшествующей беременности экстрагенитальной патологии, а генетически дерминируемое взаимодействие тканей матери и плода, определяемое геном гликопротеина GP3a, играет существенную роль при развитии осложнений беременности.
Установлены положительные корреляционные зависимости между
генотипом АДГ2 и риском развития разных форм клинической патологии у
злоупотребляющих алкоголем лиц. Обнаружено, что гетерозиготный
генотип АДГ2-1/2 определяет риск развития цирроза печени у
неинфицированных вирусами гепатита В и С пациентов на фоне хронической алкогольной интоксикации. При этом риск развития цирроза печени у инфицированных пациентов не зависит от генотипа АДГ2.
Практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы в медико-биологических исследованиях, связанных с изучением молекулярных основ этиопатогенеза лимфом и других злокачественных новообразований. Выявленный полиморфный элемент гена EBNA-3C вируса Эпщтейна-Барр позволяет использовать его в диагностических целях для определения моно- и поликлонального характера инфицированных клеток В-лимфомы и степени ее агрессивности с целью рекомендации более радикального лечения. Предложенная схема ПЦР-анализа элементов генома ВЭБ в клетках периферической крови позволяет использовать её для скрининга вирусной инфекции с целью профилактики вирусных и аутоиммунных заболеваний.
Результаты исследований подтверждают вовлеченность ретровируса типа D Мейзона-Пфайзера в патогенез В-клеточных Берктт-подобных лимфом, что может быть использовано в диагностических целях в клинической практике. Схема анализа сайта интеграции вируса в хромосомы человека может использоваться в качестве модели для молекулярно-генетических исследований механизмов вирусного онкогенеза и молекулярных основ эволюции генома человека. Обнаружение белка, ген которого поврежден вирусной вставкой, открывает новые возможности для генетической коррекции опухоли. Выявленная корреляция ВПЧ-инфекции с риском развития рака мочевого пузыря (РМП) служит рекомендацией для выделения инфицированных пациентов в группу повышенного риска.
Данные результатов исследований роли аллеля PLA2 в процессе развития РПЖ могут быть использованы в построении номограмм для прогнозировния инвазии клинически незначимых опухолей. Выявленные генетические маркеры предрасположенности к развитию РМП, РПЖ, недостаточности плацентарной системы, гестоза, ЗРП у беременных, алкогольного цирроза печени и алкогольной зависимости позволяют использовать их для проведения скрининга населения и формирования групп повышенного риска с целью проведения досимптоматической терапии и профилактических мероприятий.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на:
7-ой и 8-ой Международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы», С- Петербург, 24 -28 мая 1999; 2000.
X Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы
адаптации», Москва, 29-31 января 2001 г.
I Всероссийской конференции «Развитие научных исследований на медицинских факультетах университетов России», Москва, 23-25 января 2001г.
IY Международной конференции «Современные проблемы наркологии: биологические механизмы, диагностика, лечение, реабилитация, профилактика», Москва, 2002 г.
26 International Congress of Internal Medicine, Kyoto (Japan), 2002 r.
10-ой, Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», С- Петербург, 24-28 мая 2002 г.
Всероссийской конференции «Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия», Москва, 28-31 мая 2002 г.,
XI Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы
адаптации», Москва, 27-28 января 2003 г.
Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы артериальной гипертонии», Москва, 22-24 апреля 2003 г.,
11-ой Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», С- Петербург, 6-Ю октября 2003 г.
Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы», 22-24 октября 2003 г.
Второй Международной конференции «Патофизиология и современная медицина», 22-24 апреля 2004 г.
12-ой Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», С- Петербург, 24-28 мая 2004 г.
14-ой Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» С- Петербург, 23-27 мая 2005 г.
Положения, выносимые на защиту.
Высоковариабельный участок гена EBNA-3C вируса Эпштейна-Барр определяет моно- и поликлональный характер В-лимфомы и степень ее агрессивности.
Обнаружен клинический пример, где ретровирус типа D Мейзона-Пфайзера интегрирован в 17 хромосому человека в локусе 17q. 11.2 перед третьим экзоном гена гепатоцеллюлярной карциномы НСА-66, что соответствует схеме вирусного онкогенеза.
Инфицирование пациентов вирусом папилломы человека типа 16 ассоциировано с риском развития рака мочевого пузыря.
Предрасположенность к развитию рака мочевого пузыря и предстательной железы имеет генетическую основу и определяется носительством аллеля PLA2 гена GP3a.
Полиморфизм гена GP3a определяет уровень прогрессии
опухоли и скорость развития локальной инвазии и метастазирования при
раке предстательной железы.
Фетоплацентарная недостаточность при гестозе генетически детерминированна и вероятность этого осложнения повышается на фоне имеющейся экстрагенитальной патологии.
Генетически детерминируемое взаимодействие тканей матери и плода, определяемое геном GP3a, играет существенную роль при развитии нарушений состояния фетоплацентарной системы и задержки развития плода.
Полиморфизм гена АДГ2 определяет разные формы клинического проявления алкогольной патологии у злоупотребляющих алкоголем лиц. Население российской популяции генетически предрасположено к развитию цирроза печени при злоупотреблении алкоголем.
Публикации. По теме диссертации опубликована 31 работа в отечественных и зарубежных изданиях, получен патент на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 298 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка использованных сокращений, библиографического списка, включающего 52 отечественных и 403 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 35 рисунками.
Элементы генома вирусного происхождения и их роль в процессе онкогенеза
Элементы генома представляют собой дискретные участки ДНК, которые можно дифференцировать на основе различий их нуклеотидного состава или функциональных свойств. Геномы эукариот можно рассматривать как мультигеномные системы, состоящие из элементов клеточного и вирусного происхождения. Количество и расположение локусов клеточного происхождения в геноме достаточно постоянно, в то время как наличие вирусных последовательностей не является строго обязательным, а их количество и локализация в геноме может варьировать.
Вирусные последовательности в клетке могут существовать в интегрированном в хромосомы или не интегрированном состоянии. Интегрируя в хромосомы, вирусы не только вызывают эволюционные преобразования генома, но и становятся частью сегрегационного груза популяций человека. На сегодняшний день вирусы являются признанным этиологическим фактором злокачественных новообразований. По некоторым оценкам, около 15% всех опухолей у людей вызвано вирусами [19, 454].
В настоящее время достоверно доказано наличие онкогенной активности у пяти групп вирусов. Это ДНК-содержащие семейства паповавирусов (папилломавирусы и вирусы полиомы), аденовирусов, герпес-вирусов, гепаднавирусов и РНК-содержащие вирусы - обширная группа ретровирусов и вирус гепатита С, относящийся к семейству флавивирусов [101]. Семейство Вирус Новообразование ДНК-содержащие вирусы HPV (16, серотипы) различные серотипы Hepadnaviridae HBV Heфesviridae Gammaherpesvir EBV us Papovaviridae Papillomavirus Adenoviridae гепатоцеллюлярная карцинома лимфома Бэркитта, назофарингеальная карцинома и др. 18 рак шейки матки и др. у человека не выделены РНК-содержащие вирусы Retroviridae Flaviviridae HTLV-1 HCV Т-клеточный лейкоз взрослых гепатоцеллюлярная карцинома (?) HBV (hepatitis В virus) - вирус гепатита В, EBV (Epstein-Barr virus) -вирус Эпштейна-Барр, HPV (human papilloma virus) - вирус папилломы человека, HTLV-1 (human T-cell leukemia virus type 1)- вирус T-клеточного лейкоза человека 1 типа, HCV (hepatitis С virus) - вирус гепатита С
Изменяя генетический аппарат клетки-хозяина, вирусы способны активировать либо клеточные онкогены, либо собственные, что приводит к трансформации клеток. Таким образом, вирусный онкогенез имеет генетическую основу, а возникновние опухолей - своего рода случайный эффект репликативных стратегий вируса, длительно персистирующего в организме человека.
Инфекционная природа вирусов отличает их от других канцерогенов. Вирусы обычно являются неполными канцерогенами, для возникновения опухоли необходимы дополнительные события.
Роль вируса в трансформации может быть различной. ДНК-содержащие опухолеродные вирусы кодируют вирусные онкобелки, необходимые для репликации вируса и трансформации клетки-хозяина.
Трансформирующие ретровирусы несут онкогены клеточного происхождения или изменяют экспрессию клеточных белков, задействованных в регуляции клеточного деления и роста [19, 59, 68, 297]. Существует по меньшей мере 4 механизма ретровирусного онкогенеза [79]. А. Трансдукция
При потере 3 LTR интегрированным провирусом отсутствует сигнал терминации транскрипции, в результате чего вместе с вирусным геномом могут транскрибироваться клеточные гены, расположенные ниже места интеграции. Такими генами могут оказаться клеточные протоонкогены. Затем при рекомбинации с нормальной провирусной ДНК во время обратной транскрипции провирусный геном с захваченным геном получает нормальный 3 LTR. Также в процессе обратной транскрипции могут происходить дополнительные мутации в захваченном гене. Последним этапом является интеграция провирусной ДНК и, соответственно, захваченного онкогена в ДНК клетки-хозяина (рис. 1).
В. Инсерционная активация.
При интеграции провирусной ДНК в геном клетки-хозяина выше клеточного протоонкогена последний может попадать под энхансерное влияние LTR. В результате экспрессия протоонкогена возрастает (рис.2).
Детекция ДНК вируса Эпштейн-Барр в клетках периферической крови методом ПЦР
Для выявления элементов генома вируса Эпштейна-Барр в клетках периферической крови и определения частоты инфицированости ВЭБ среди пациентов с заболеваниями лимфопролиферативного характера были проанализированы образцы ДНК 11 больных детей в возрасте от 8 до 15 лет с злокачественными заболеваниями лимфоидного происхождения и их здоровых матерей (см. табл.3). В качестве контроля исследовали образцы ДНК, выделенной из клеток периферической крови 50 беременных женщин в возрасте от 20 до 40 лет без опухолевых заболеваний.
ДНК вируса Эпштейна - Барр (ВЭБ) обнаружена в клетках периферической крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров, специфичных для участка гена EBNA - ЗС вируса ВЭБ. Дизайн праймеров для ПЦР-анализа осуществляли с использованием программы Primer 3 (http://www-genome.wi.mit.edu/primer3.cgi). Для подбора праймеров использовали последовательности полного генома вируса, приведенные в Gene Bank NID g59074. Схема анализа исследуемого участка генома ВЭБ (внутренней области гена EBNA-3C) методом ПЦР представлена на рисунке 12.
При этом исследовании размер амплифицированного фрагмента ДНК должен составлять 227 п.н. для ВЭБ типа 1 и 350 п.н. для ВЭБ типа 2.
Вторая пара праймеров (№3 и №4, рис.12) комплементарна фланкирующим участкам первоначально синтезированного полноразмерного фрагмента ДНК и позволяет амплифицировать внутренний фрагмент ДНК размером 153 п.н., используя в качестве матрицы первоначально синтезированный фрагмент ДНК.
Подобный прием, позволяющий использовать два раунда амплификации и две пары олигонуклеотидных праймеров, одна из которых является внутренней по отношению к первоначально синтезированному полноразмерному фрагменту ДНК, носит название «nested PCR» и используется в молекулярно-генетических исследованиях для точного подтверждения результатов амплификации исследуемого участка генома и специфичности синтезированного продукта.
Реакцию ПЦР и электрофорез в полиакриламидном геле проводили по стандартной методике, гель окрашивали азотнокислым серебром и сканировали для последующей компьютерной обработки результатов амплификации. В качестве маркерной ДНК при электрофоретическом анализе продуктов ПЦР использована ДНК плазмиды pUC19, обработанная рестриктазой НаеШ. Результаты электрофоретического анализа продуктов амплификации, полученных при использовании праймеров №1 и №2, приведены на рисунке 13.
Электрофоретический анализ продуктов ПЦР показал, что во всех исследуемых образцах размер синтезированного фрагмента ДНК составляет 227 п.н., что свидетельствовует о наличии ДНК ВЭБ типа 1 в клетках периферической крови всех пациентов и здоровых доноров данной группы исследования.
При этом исследовании ДНК ВЭБ типа 1 зарегистрирована у 16 из 19 пациентов исследуемой группы. В контрольной группе из 50 пробандов ДНК ВЭБ типа 1 была зарегистрирована в 35 образцах. Данные о регистрации ДНК ВЭБ в клетках периферической крови пациентов методом ПЦР приведены в таблице 4.
Как видно из таблицы 4, в клетках периферической крови всех больных детей с В - клеточными лимфомами и их здоровых матерей (пробанды №1 - №9) методом ПЦР зарегистрированы нуклеотидные последовательности ДНК ВЭБ типа 1.
Для пациентов с лимфобластной Т - лимфомой (пробанды №10 -№12) такое инфицирование не является обязательным, поскольку в клетках крови пациента №12 элементы генома ВЭБ в этом исследовании не были зарегистрированы.
Среди пациентов с крупноклеточной анаплазированной лимфомой В-типа и их здоровых матерей ( пробанды №13 - №18) элементы генома ВЭБ- не зарегистрированы у пациента №13. Таким образом, ВЭБ -инфицирование пациента при анаплазированной крупноклеточной лимфоме также необязательно, причем больной может не иметь вируса даже при его наличии в клетках периферической крови матери (пробанды №13 и №14, табл.4).
В периферической крови пациента с рецидивирующим лимфогранулематозом (пробанд №19) вирус при этом исследовании зарегистрирован не был.
Таким образом, при исследовании образцов ДНК клеток периферической крови элементы генома ВЭБ зарегистрированы у 16 из 19 пробандов обследованной группы, что составляет 84% инфицированное
Анализ сайтов интеграции последовательностей вируса Мейзона-Пфайзера в хромосомы человека
Для определения хромосом, в которые произошла интеграция генома MPMV, проводился компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей рекомбинантных клонов посредством поиска по GenBank с помощью нуклеотид-нуклеотидного BLAST. Были проанализированы 4 последовательности фрагментов ДНК, обозначенные как Seq_19, Seq_23, Seq_16-20 и Seq_51, содержащие отрезок LTR интегрированного генома ретровируса Мейзона-Пфайзера и фланкирующий его участок ДНК генома человека.
Для двух последовательностей (Seq_16-20 и Seq_51) сайты интеграции провируса в геном человека были определены однозначно и локализовались в 10-ой и 17-ой хромосомах человека, соответственно.
Анализ последовательности Seq_19 показал, что вставка, вероятнее всего, произошла в 7-ю хромосому, однако статистически значимые, но значительно более короткие и менее точные совпадения последовательностей имелись и на других хромосомах. Интересно отметить, что по сравнению с нуклеотиднои последовательностью участка 7-ой хромосомы, имеющейся в базе GenBank, в нашей последовательности имеются два коротких участка замены (длиной 7 и 18 п.о.).
Анализ полной последовательности Seq_23 показал, что она была значительно контаминирована последовательностями вектора, использовавшегося для формирования библиотек фрагментов ДНК, обогащенных участками генома человека, непосредственно прилегающими к LTR вируса Мейзона-Пфайзера.
Для дальнейшего поиска сайта интеграции был использован фрагмент последовательности Seq_23, некомплементарный плазмидной последовательности. При этом было установлено, что вставка, скорее всего, произошла во 2-ю хромосому, однако, как и в случае Seq_19, имелись и другие «попадания» с более низкой статистической значимостью совпадения.
С помощью UCSC BLAT затем были определены координаты совпадений на целой хромосоме.
Длина каждой проанализированной последовательности, номера хромосом, в которые произошла интеграция, их описание по GenBank, длины совпадений и их координаты по Human Working Genome Draft представлены в таблице 6.
Для определения точки разрыва LTR вируса Мейзона-Пфайзера, произошедшего при его интеграции в геном человека, потребовалось применить попарный нуклеотидный BLAST. Сравнивались анализируемые последовательности с полной нуклеотидной последовательностью генома ретровируса Мейзона-Пфайзера, представленного в GenBank (accession М12349, gi:334702).
Для последовательностей Seq_19 и Seq_23 точка разрыва LTR MPMV локализовалась внутри участка U3 на уровне 27 нуклеотида от начала U3. Оба найденных участка LTR были полностью идентичны. Оказалось, что это последовательность использовавшегося для детекции вируса праимера AU3-234, комплементарного участку U3 MPMV.
Разрыв LTR вируса для последовательности Seq_16-20 был также картирован внутри U3 на уровне 29 нуклеотида от его начала. Этот участок LTR вируса оказался на 2 п.н. короче, чем два предыдущих LTR участка. В остальных последовательностях все три участка разрыва совпадали.
Для Seq_51 точка разрыва последовательности провируса, возникшая при его интеграции в геном человека, была установлена еще на предыдущем этапе при анализе с помощью NCBI BLAST. В этом случае почка разрыва локализовалась примерно на 18 п.о. ранее начала неполного U3, т.е. как раз совпадала с началом U3, если бы он был полным. Таким образом, несмотря на замену части нуклеотидной последовательности U3, произошедшую в результате некоего рекомбинационного события, этот LTR остается полностью функционально активным. Такая точка разрыва U3 соответствует описанной ранее, и этот вариант интеграции является характерным для вируса MPMV.
Аллельное распределение гена GP3A в группах беременных женщин с гестозами и фетоплацентарной недостаточностью, контроля и в популяции
Для дальнейшего анализа распределения генотипов по гену GP3A среди пациенток с гестозами и/или патологией ФПС все пациентки распределялись по группам исследований в зависимости от различных сочетаний обоих диагнозов. Данные о количестве пациенток и частотах носителей аллелей PLA1 и PLA2 в каждой группе приведены в табл.11.
В группе пациенток с гестозами и патологией ФПС (I группа) зарегистрировано 25 пациенток с генотипом PLA1PLA1, что составило 64,1% от общего числа пациенток в данной группе, и 14 (35,9%) носительниц гена PLA2, в том числе 13 гетерозиготных носительниц аллеля PLA2 и одна гомозиготная. В III группе пациенток с патологией ФПС без гестоза выявлено 14 пациенток с генотипом PLA1PLA1, что составило 66,7% от количества пациенток данной группы, и 7 (33,3%) гетерозиготных носительниц алллеля PLA2. Таким образом, среди пациенток с гестозом и патологией ФПС (I группа) и с патологией ФПС без гестоза (III группа) частоты встречаемости гетерозиготных носителей аллеля PLA2 составляют 35,9% и 33,3%, соответственно, что не имеет достоверных статистических отличий (р=0,85).
В группе пациенток с поздним гестозом без патологии ФПС (II группа исследования) выявлено значительное снижение частоты встречаемости гетерозиготных носительниц аллеля PLA2. Среди 64 пациенток этой группы выявлено 6 гетерозиготных носительниц аллеля PLA2, что составляет 9,4% . Данная частота гетерозиготных генотипов в этой группе достоверно отличается от соответствующих частот в других группах исследования и в популяции (р 0,01).
Частота аллеля PLA2 во II группе исследования составила 4,7%, что достоверно отличается от частот соответствующего аллеля в группах пациенток с гестозами и патологией ФПС (19,2%), пациенток с патологией ФПС без гестозов (16,7%) и пациенток с физиологическим течением беременности (14%).
Полученные результаты позволяют предположить, что наличие в генотипе женщины аллеля PLA2 с высокой степенью вероятности определяет предрасположенность к развитию патологии ФПС, причем вероятность этой патологии одинакова для пациенток с гестозами и без гестозов. При этом наличие только аллеля PLA1 в генотипе женщины коррелирует с развитием позднего гестоза, но не фетоплацентарной недостаточности.
Для более подробного изучения аллельного распределения гена GP3a среди женщин с гестозами и/или патологией ФПС мы проводили окончательное распределение женщин по группам исследования, принимая во внимание, что среди пациенток встречаются гестозы двух типов: без соматической патологии (чистый гестоз) и с предшествующей экстрагенитальной патологией (сочетанный гестоз).
Все пациентки были разделены на пять групп: "чистый" гестоз без ФПН (1-я группа), "чистый" гестоз с патологией ФПС (2-я группа), сочетанный гестозом без патологии ФПС (3-я группа), сочетанный гестоз с патологией ФПС (4-я группа) и патология ФПС без гестоза (5-я группа). В табл.5.3 представлены данные об абсолютном и относительном количестве носителей аллеля PLA2 в разных группах исследования.
Данные, приведенные в табл.5.3 показывают, что чистый гестоз диагностирован у 55 женщин. Из них у 21 пациентки (2-я группа) гестоз сопровождался патологией ФПС, у 34 пациенток (1-я группа) гестоз не сопровождался патологией ФПС. В группе пациенток с чистым гестозом частота гетерозиготного генотипа PLA1PLA2 составила 21,8%, а аллеля PLA2 - 11,8%, что достоверно не отличается от частот соответствующего генотипа и аллеля PLA2 в популяции (р= 0,85).
В группе пациенток с чистым гестозом и патологией ФПС выявлено 6 (28,6%) носительниц генотипа PLA1PLA2, частота аллеля PLA2 составила 16,7%. В 1-ой группе пациенток без патологии ФПС (п=34) зарегистрировано 6 (17,6 %) носительниц гена PLA2. Частота аллеля PLA2 в этой группе составляет 8,8%. Данное значение достоверно отличается от частоты аллеля PLA2 во 2-ой группе пациенток с патологией ФПС (16,7%) и от соответствующей частоты данного аллеля в популяции (р 0,05).
У 48 женщин беременность возникала и протекала на фоне имеющейся соматической патологии, при наличии которой в поздние сроки беременности развивался сочетанный гестоз. В этой группе пациенток зарегистрировано 8 (16,7%) женщин с гетерозиготным генотипом PLA1PLA2. В этой группе пациенток отмечено снижение частоты аллеля PLA2 (8,3%), что достоверно отличается от частоты данного аллеля в популяции (р 0,05).
У 30 пациенток (3-я группа) диагностирован гестоз без патологии ФПС. В этой группе не зарегистрировано носителей аллеля PLA2. Среди 18 пациенток с сочетанным гестозом и патологией ФПС (4-я группа) выявлено 8 (44,4%) гетерозиготных носителей аллеля PLA2, а частота этого аллеля в этой группе исследования составляет 22,2%.
В 5-ой группе пациенток с патологией ФПС без гестоза зарегистрировано 7 (33,3%) гетерозиготных носителей гена PLA2, а его частота составила 16,7%. Частота аллеля PLA2 в этой группе достоверно не отличается от таковой в популяции (р= 0,85).
