Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Происхождение и расселение современного человека 14
1.2. Генетическое разнообразие населения Северной Евразии 19
1.3. Генетические исследования иммунозависимых заболеваний 22
1.4. Эволюция генетического разнообразия и болезни человека
1.4.1. Представления о роли эволюционных факторов в развитии заболеваний человека 27
1.4.2. Поиск сигналов отбора в популяциях человека 30
1.4.3. Изменчивость частот аллелей в генах иммунного ответа 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы 38
2.1. Характеристика популяционных групп 38
2.2. Характеристика SNP маркеров 43
2.3. Методы исследования
2.3.1. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 47
2.3.2. Масс-спектрометрия MALDIOF 48
2.4. Статистический анализ полученных данных 51
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Генетическое разнообразие и дифференциация исследованных популяций
человека по генам, ассоциированным с иммунозависимыми фенотипами 53
3.1.1. Генетическое разнообразие в популяциях 53
3.1.2. Генетическая дифференциация популяций 69
3.1.3. Генетические взаимоотношения между популяциями и связь главных компонент аллельных частот с климато-географическими факторами 71
3.1.4. Исследование популяций по структуре их предковых компонентов 76
3.2. Связь генетической структуры изученных популяций человека по генам, ассоциированным с иммунозависимыми фенотипами, с климато 3 географическими характеристиками и с уровнем инфекционной и паразитарной нагрузки 77
3.2.1. Исследование корреляции генетического разнообразия с климато-географическими факторами 77
3.2.2. Исследование корреляции генетического разнообразия с распространенностью инфекционных и паразитарных заболеваний 86
3.2.3. Исследование корреляции генетического разнообразия с видовым разнообразием гельминтов 89
3.3. Оценка селективной нейтральности исследованных генетических маркеров 92
3.3.1. Тесты, направленные на отдельные SNP 92
3.3.2. Тесты, направленные на структуру неравновесия по сцеплению и вариабельность гаплотипов 96
3.4. Сравнительный анализ полученных данных 102
Заключение 107
Выводы 110
Список литературы 112
- Генетические исследования иммунозависимых заболеваний
- Полимеразная цепная реакция в реальном времени
- Генетическое разнообразие в популяциях
- Исследование корреляции генетического разнообразия с климато-географическими факторами
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Анализ генетической структуры популяций человека используется для исследования генетического разнообразия и дифференциации населения и позволяет реконструировать генетическую историю, миграции и расселение современного человека, изучать действие естественного отбора в ходе адаптации популяций к условиям среды обитания. Исследование генетического разнообразия служит основой для выявления роли генетической компоненты в развитии болезней человека. Одним из направлений современной генетики человека и медицинской генетики является анализ многофакторных заболеваний (МФЗ), учитывая их распространенность в мире и ведущую роль в заболеваемости и смертности населения. Болезни иммунной природы составляют существенную группу МФЗ, поэтому изучение их генетических механизмов ведется особенно активно, в том числе и российскими учеными (Фрейдин М.Б., Пузырев В.П., 2010; Степанов В.А. и др., 2013а; Огородова Л.М. и др., 2013; Карунас А.С., Хуснутдинова Э.К., 2013; Куликов Е.С. и др., 2014; Фрейдин М.Б. и др., 2015).
Современными исследователями представлен ряд гипотез и концепций,
объясняющих вариабельность заболеваний в популяциях и связанных с ними
генетических маркеров, ключевыми из которых являются гипотезы
канализации/деканализации, «экономных генов» и «предковой
предрасположенности» (Neel J.V., 1962; Di Rienzo A., Hudson R.R., 2005; Gibson G., 2009). В отношении генов иммунного ответа предложена гипотеза, согласно которой, в процессе миграции популяций человека за пределы Африки на территорию с умеренным и арктическим климатом и с другим уровнем паразитарных и инфекционных заболеваний могло происходить снижение действия направленного отбора на аллели SNP, адаптивные для африканских популяций и связанные с защитой организма от паразитарных инвазий (Le Souf P.N., 2000). Данное изменение, вероятно, привело к увеличению частоты альтернативного аллеля в мигрирующих популяциях. Подобное преобразование, могло способствовать распространению иммунозависимых болезней в популяциях, расположенных за пределами Африки.
Этнические группы Северной Евразии, особенно Дальнего Востока и Сибири, проживают на территории, где преобладает холодный, умеренный и арктический климат. В популяциях Северной Евразии проведены обширные исследования по изменчивости аутосомных маркеров, маркеров X-хромосомы, Y-хромосомы и митохондриальной ДНК (мтДНК), описавшие структуру генофонда населения Северной Евразии с высоким меж- и внутрипопуляционным генетическим разнообразием (Степанов В.А., 2002; Голубенко М.В. и др., 2002; Хитринская И.Ю. 2003с, 2014; Балановская Е.В., Балановский О.П., 2007; Деренко М.В., Малярчук Б.А. 2010; Харьков В.Н., 2012; Yunusbayev B. et al, 2012; Губина М.А. и др., 2013а, 2013b; Хуснутдинова Э.К. и др., 2014; Балановский О.П. и др., 2015; Посух О.Л. и др., 2016). Однако роль естественного отбора и адаптивной эволюции в формировании
генетических характеристик популяций человека, проживающих на территории Северной Евразии, изучена слабо.
Мы предполагаем, что приспособительная эволюционная изменчивость могла привести к формированию особенностей структуры генофонда популяций Северной Евразии, специфических частот встречаемости заболеваний, в том числе и иммунозависимых, и связанных с ними полиморфных ДНК-маркеров. Следовательно, Северная Евразия является интересным объектом для исследования генетической структуры популяций по генам, ассоциированным с иммунозависимыми фенотипами.
Степень разработанности темы исследования
Проведены многочисленные исследования ассоциации частот аллелей генов иммунозависимых фенотипов в различных популяциях, как при анализе отдельных генетических маркеров, так и в составе полногеномных исследований (Abecasis G.R. et al., 2010; Frazer K.A. et al., 2007; Cann H.M. et al., 2002; Martin A.M. et al., 2003; Yunusbayev B. et al, 2012; Хуснутдинова Э.К. и др., 2014). Показано действие отбора по полиморфизму генов иммунного ответа (Walsh E.C. et al., 2006; Barreiro L.B., Quintana-Murci L., 2010; Sabeti et al., 2006, Hancock et al., 2010; Saeb A.T., Al-Naqeb D., 2016). В отношении к микроэволюционным процессам представлены различные концепции и гипотезы, объясняющие вероятные механизмы действия естественного отбора в популяциях человека (Neel J.V., 1962; Le Souf P.N. 2000; Di Rienzo A., Hudson R.R., 2005; Gibson G., 2009).
Учитывая большое число этнических групп, проживающих на территории Северной Евразии, анализ генетической структуры популяций Северной Евразии совместно с мировыми популяциями по SNP, задействованных в развитии иммунозависимых фенотипов, для обнаружения влияния естественного отбора по данным генетическим маркерам, является актуальным и в настоящее время.
Цель исследования: оценить роль адаптивной эволюции генетического разнообразия в формировании генетической структуры популяций человека по полиморфизму генов, ассоциированных с иммунозависимыми фенотипами.
Задачи
-
Оценить генетическое разнообразие популяций Северной Евразии по генам, ассоциированным с иммунозависимыми фенотипами.
-
Проанализировать генетическую дифференциацию мировых популяций по исследованным генетическим маркерам на основе собственных данных и данных из международных проектов.
-
Оценить связь частот аллелей генов, ассоциированных с иммунозависимыми фенотипами, и общего генетического разнообразия с климато-географическими факторами, распространенностью инфекционных и паразитарных заболеваний.
-
Выявить генетические маркеры, подверженные действию естественного отбора в ходе расселения современного человека.
Научная новизна
В работе впервые в широком спектре популяций Северной Евразии совместно с
мировыми популяциями проведено исследование частот аллелей генов,
ассоциированных с иммунозависимыми фенотипами, с помощью молекулярно-генетических и биоинформационных методов анализа. Значительный охват населения различных регионов мира позволил наиболее детально описать картину адаптивного изменения частот аллелей в процессе расселения современного человека по территории земного шара. В ходе выполнения работы рассмотрена гипотеза канализации/деканализации геном-феномных отношений по генам, ассоциированным с иммунозависимыми фенотипами. Получены новые данные о роли адаптивной эволюции в формировании генетического разнообразия. Выявлена роль климато-географических факторов, инфекционной и паразитарной нагрузки в распределении аллельных вариантов генов. Результаты данного исследования показали действие естественного отбора по изученным генетическим маркерам.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическая значимость работы заключается в выявлении генетических механизмов адаптации популяций человека к изменяющимся условиям окружающей среды, расширении представлений о генетическом разнообразии населения Северной Евразии. Практическая значимость исследования заключается в возможности использования полученных данных в области молекулярной эпидемиологии распространенных заболеваний, в ассоциативных исследованиях и при разработке генетических тест-систем для болезней, связанных с нарушениями иммунного ответа.
Результаты исследования имеют междисциплинарное значение и могут быть применены в планировании и развитии дальнейших задач эволюционной, популяционной и медицинской генетики. Материалы работы могут быть использованы в учебном процессе медико-биологических факультетов ВУЗов.
Методология и методы исследования
Основу методологии диссертации составили анализ генетического
разнообразия популяций человека, анализ ассоциаций генетических маркеров с заболеваниями, исследования по выявлению действия естественного отбора. В работе использованы такие молекулярно-генетические методы, как полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, MALDI-TOF масс-спектрометрия. Проведен статистический анализ полученных данных совместно с данными из проектов «1000 геномов» и HGDP.
Положения, выносимые на защиту
-
Популяции Северной Евразии характеризуются высоким уровнем генетической дифференциации по генам, ассоциированным с иммунозависимыми фенотипами. В отличие от данных по условно-нейтральным маркерам, по полиморфизму генов иммунозависимых фенотипов наблюдается рост генетического разнообразия по мере удаления от Экватора в ходе расселения современного человека по земному шару.
-
Общий уровень генетического разнообразия по полиморфным генетическим маркерам, ассоциированным с иммунозависимыми фенотипами, а также частоты аллелей отдельных маркеров коррелируют с изменением климато-географических факторов, с уровнем инфекционной и паразитарной нагрузки.
3. Некоторые гены, ассоциированные с иммунозависимыми фенотипами,
находятся под действием естественного отбора.
Степень достоверности полученных результатов
Достоверность полученных результатов работы обосновывается большим объемом исследуемых популяционных выборок, использованием современных экспериментальных методов (полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, MALDI-TOF масс-спектрометрия) и методов статистического анализа полученных данных.
Апробация материалов диссертации
Основные положения диссертационной работы были представлены на
международной научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы
медицинской генетики» (Томск, 2016); X научной конференции «Генетика человека и
патология: проблемы эволюционной медицины» (Томск, 2014); VIII всероссийской
научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная
диагностика» (Москва, 2014); международной конференции
«Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск, 2013); международной конференции «Проблемы генетики населения и этнической антропологии» (Москва, 2013).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 14 работ (4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в сборнике, 8 тезисов в материалах зарубежных и отечественных конференций, зарегистрирована 1 база данных).
Личный вклад автора
Личный вклад автора заключается в поиске и анализе литературы по теме исследования, проведении экспериментальной работы и в статистическом анализе результатов совместно с данными, полученными из проектов «1000 геномов» и HGDP, в написании диссертационной работы.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 211 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения), заключения, выводов, списка условных сокращений, и списка литературы, включающего 324 источника, из них 67 отечественных и 257 иностранных. Работа содержит 29 таблиц и 26 рисунков.
Генетические исследования иммунозависимых заболеваний
Анализ вариабельности полиморфных ДНК-маркеров тесно связан с ассоциативными исследованиями заболеваний, среди которых активно изучаются многофакторные заболевания по причине их распространенности в популяциях человека. В контексте генетического анализа МФЗ аутоиммунные и аллергические болезни занимают немаловажное место, т.к. в том числе и на их основе обрабатываются основные идеи подобных работ [Vercelli D., 2008, 2010; Chuang Y.H. et al., 2009; Maes T. et al., 2011; Zhang Y. et al., 2012; Ceccarelli F. et al., 2016]. Генетический контроль действия иммунного ответа сложился в течение длительного времени в результате влияния среды обитания на популяции человека. Полиморфизм генов иммунозависимых фенотипов может быть значимой составляющей адаптации популяций к условиям среды.
Важность генетической компоненты в развитии иммунозависимых заболеваний доказывается при анализе конкордантности у близнецов. В частности, по ревматоидному артриту (РА) показатель конкордантности ниже среди дизиготных близнецов (2%-4%), по сравнению с монозиготными (12%-15%); по системной красной волчанке (СКВ) – ниже у дизиготных (0%-5%), чем у монозиготных (25%-57%); по болезни Крона (БК) значение конкордантности у дизиготных составило 3%-5%, у монозиготных – 20%-50%, по астме у дизиготных – 24%, у монозиготных – 59% [Sarafino E.P., Goldfedder J., 1995; Thompson N.P. et al., 1996; Grennan D.M. et al., 1997;Seldin M.F. et al., 1999].
Формирование иммунозависимых фенотипов связано с действием генов главного комплекса гистосовместимости (HLA), расположенных на коротком плече шестой хромосомы и включающих более 220 генов [Robinson J. et al., 2001; Jacobson E.M. et al., 2008]. Приблизительно последние 40 лет ведется изучение ассоциации генов HLA с сахарным диабетом первого типа (СД1). В 1970-х несколько групп ученых нашли ассоциацию генов HLA с СД1 [Singal D.P., Blajchman M.A., 1973; Nerup J. et al., 1974]. Позднее было показано, что HLA-DR4 и HLA-DR3 тесно связаны с СД1, а их сочетание приводит к более высокому риску проявления данного заболевания [Thomsen M. et al., 1975; Thomson G., 1988].
В ряду полиморфизма генов HLA одни из самых достоверно ассоциированных маркеров с системной красной волчанкой (СКВ) является HLA-DR2 (HLADRB1 15 и HLA-DRB1 16) [Liphaus Bde L. et al., 2002; Lpezello A. et al., 2007]. В популяциях европейцев показана ассоциация HLA-DRB1 03 и HLA-DRB1 11 с СКВ, в популяциях Малайзии – HLA-А 1101, HLA-А 1102, DRB5 0102, DQB1 05, DRB3 0101, DRB3 0201, DRB3 0202, DRB3 0203, DRB3 0301, DQB1 0301, DQB1 0304 с СКВ [Rahman A., Isenberg D.A., 2008; Chai H.C. et al., 2012]. В популяциях египтян выявлена ассоциация DR4 и DR13 с СКВ [El Sherbini H.M. et al., 2009].
Показана связь генов HLA с ревматоидным артритом (РА), системным склерозом (СС), псориазом и другими заболеваниями [Viatte S. et al., 2015; Zhou X. et, 2009; Галимова и др., 2007; Суслова Т.А. и др., 2008]. В целом, полиморфизм генов HLA является одним из значимых маркеров предрасположенности к заболеваниям иммунной системы, так, например, выявлено, что HLA-опосредованные гены составляют приблизительно 50% от генетической предрасположенности к СД1 [Ounissi-Benkalha H., Polychronakos C., 2008]. Среди генов, не относящихся к системе HLA, можно отметить PTPN2, PTPN22 и CTLA4, которые достоверно ассоциированы с иммунозависимыми заболеваниями, в частности показана их роль в развитии РА, СД1, СКВ [Scalapino K.J., Daikh D.I., 2008; Lessard C.J. et al., 2012; Parkes M. et al., 2013]. Следует выделить гены, связанные с дифференцировкой Т-клеток, такие как IL12, STAT3, IFNy (дифференцировка Т-хелперов первого типа (ТЫ)); IL4, IL6 (дифференцировка Т-хелперов второго типа (Th2)); IL21, IL23R (дифференцировка Т-хелперов 17 типа (ТЫ 7)); IL2, TGF/3 (дифференцировка регуляторных Т-клеток (Treg)) [Zhu J. et al, 2010; Zheng S.G., 2013; Oh H., Ghosh S., 2013].
Развитие иммунозависимых заболеваний отчасти связано с дисбалансом в дифференцировке различных типов Т-хелперов (Th). Так, например, Th1 -клетки производят интерферон гамма и обеспечивают защиту от вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций. ТЫ-тип также задействован в формировании противоопухолевого иммунитета [Galaine J. et al, 2015]. Смещение баланса в направлении Тп2-клеток, которые имеют решающее значение в борьбе с паразитами, такими как гельминты, способствует развитию аллергических заболеваний [McSorley H.J., Maizels R.M., 2012]. Сравнительно недавно исследованы ТЫ7-клетки, отвечающие за защиту от бактерий через секрецию интерлейкинов IL17A, IL17F и IL2, но гораздо больше доказана за их роль в развитии аутоиммунных заболеваний [Zhou L. et al., 2009]. Регуляторные Т-клетки (Tregs), которые ингибируют пролиферацию Т-клеток, также имеют решающее значение в снижении активации иммунной системы и аутоиммунных реакций [Pellerin L., et al, 2014]. Сдвиг TH17/Treg ассоциирован с развитием СКВ [Talaat R.M. et al., 2015]. Дисбаланс Treg/Th1 и Treg/Th17 типов иммунного ответа связан с БК и является потенциальным показателем для прогнозирования рецидивов, а дисбаланс Thl/Th2 вовлечен в развитие болезни Грейвса [Chao К. et al, 2014; Esfahanian F. et al., 2013].
Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Работа выполнена с привлечением научно-исследовательского оборудования ЦКП "Медицинская геномика" при НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ. Для анализа пяти полиморфных генетических маркеров (rs1042714, rs1800872, rs1800925, rs2243250 и rs3212227) проводили генотипирование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени на амплификаторе «Bio-Rad» (США). Детекция ПЦР-продуктов осуществлена с помощью подхода линейных разрушаемых проб (TaqMan) [Ребриков Д.В. и др., 2009].
Смесь объемом 13 мкл для проведения реакции содержала: буфер 10-кратный (2 мкл), четыре вида дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTPs) (2 мкл), MgCl2 (3 мкл), DMSO (1,5 мкл), меченные FAM и HEX флюоресцентные зонды (0,08 мкл), термостабильную ДНКaq-полимеразу (0,08 мкл), деионизованную воду (4,34 мкл). ПЦР в реальном времени проводили по схеме: 1 цикл для активации при 95С (10 мин.), 40 циклов денатурации при 92С (15 сек.) и отжига при 60С (1 мин.). Визуализация продуктов амплификации проводилась с использованием программного обеспечения «BioradCFXManager» (рис. 8).
Мультиплексное генотипирование остальных 39 полиморфных генетических маркеров проводили с помощью масс-спектрометрии MALDIOF на генетическом анализаторе Sequenom MassARRAY Analyzer 4 [Gabriel S. et al., 2009; Степанов В.А., Трифонова Е.А., 2013b]. Данный метод включает ряд этапов: мультиплексная ПЦР, SAP-реакция, iPLEX-реакция, ионизация и анализ спектров. Праймеры для выбранных генетических маркеров произведены компанией «Metabion» (Германия). Последовательность прямых и обратных праймеров представлены в таблице 2 приложения. Для накопления необходимых фрагментов ДНК проводили мультиплексную ПЦР на амплификаторах «Applied Biosystems» (США) и «Thermo Scientific» (Германия). В состав смеси для реакции объемом 5 мкл добавляли: 10 ng/1ДНК (1мкл), буфер 10-кратный с 20 mM MgC12 (0,5мкл) («Sequenom»), 25 mM смеси dNTPs (0,1 мкл) («Sequenom»), 25 mM MgCl2 (0,4 мкл) («Sequenom»), 0,5 uM праймеров (1,0 мкл), 5U/1 PCR фермент (0,2 мкл) («Sequenom»), деионизованную воду (1,8 мкл). Мультиплексную ПЦР проводили по схеме: 1 цикл денатурации (94С, 5 мин.), далее 42 цикла амплификации: денатурация (94С, 20 сек.), отжиг (56С, 40 сек.), элонгация (72С, 60 сек.), затем инкубация пробы (5 мин., 72С).
Для удаления не инкорпорированных дезоксинуклеозидтрифосфатов из продуктов мультиплексной амплификации проводили SAP-реакцию. На данном этапе с применением щелочной фосфатазы (SAP) производится дефосфорилирование не вошедших в состав ампликона dNTPs. Для этого в полученные на этапе мультиплексной ПЦР продукты амплификации добавляли смесь SAP, содержащую SAP-буфер (0,17 мкл) («Sequenom»), 1,7U/u1 SAP-фермент (0,30 мкл) («Sequenom»), деионизованную воду (1,53 мкл). Затем производилась инкубация образцов при 37С (40-50 мин.) и далее для инактивации щелочной фосфатазы – инкубация при 85С (5-20 мин.).
На следующем этапе производится однонуклеотидное удлинение праймеров с включением дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). Смесь для iPLEX-реакции содержала: iPLEX-буфер десятикратный (0,200 мкл) («Sequenom»), iPLEX-фермент (0,041 мкл) («Sequenom»), смесь праймеров (0,940 мкл), iPLEXTermination Mix (0,200 мкл), деионизованную воду (0,619). Амплификация была осуществлена на амплификаторах «Applied Biosystems» (США) и «Thermo Scientific» (Германия) по схеме: 1 цикл денатурации (94С, 30 сек.), затем 40 циклов: денатурация (94С, 5 сек.), отжиг (52С, 5 сек.), элонгация (80С, 5 сек.), далее инкубация образцов (72С, 5 мин.).
Затем проводили очистку продуктов реакции (удаление ионов K+, Na+ и Mg2+) с помощью смолы SpectroCLEAN («Sequenom») для снижения уровня фонового шума при анализе в масс-спектрометре. После добавления смолы SpectroCLEAN и деионизованной воды 96-луночные планшеты вращали на ротаторе (15 мин), затем центрифугировали (4000 об/мин, 5 мин). Из 96-луночных планшетов производили перенос образцов на спектро-чип («Sequenom») в режиме автоматического управления с помощью Nanodispenser RS1000 («Sequenom»). Далее после ионизации образцов из спектро-чипа и разделения по массе ионизованных частиц в камере масс-спектрометра анализировали полученные данные при помощи программного обеспечения MassARRAY TYPER 4.0 («Sequenom») (рис. 9, 10).
Генетическое разнообразие в популяциях
Большинство исследованных локусов являются полиморфными, кроме локуса rs144651842 в нескольких популяциях Северной Европы (украинцы, цезы, бежтинцы и агульцы), rs1805015 в двух популяциях Северной Азии (нивхи и коряки). Мономорфность показана по локусу rs6441286 у казахов, нивхов и тувинцев. Генетические маркеры rs9888739, rs2476601 и rs4986790 были мономорфны в нескольких популяционных выборках Северной Азии: rs9888739 у чукчей и тувинцев, rs2476601 у южных алтайцев, тувинцев, удэгейцев, нивхов и чукчей, rs4986790 у кетов, бурятов, якутов, нивхов и коряков.
В работе выявлены генетические маркеры, предковые аллели которых больше распространены в популяциях Северной Евразии монголоидного расового типа по сравнению с европеоидами и наоборот (рис. 11). У монголоидов частота предкового аллеля оказалась выше по локусам rs1335532, rs2300747, rs2243250, rs11150610, rs13277113, rs2736340; у европеоидов – по локусам rs2070874, rs2227284, rs485499, rs3890745, rs2381416 и rs2430561.
Частоты предковых аллелей маркеров rs1335532, rs2300747, rs2243250, rs11150610, rs13277113, rs2736340, rs2070874, rs2227284, rs485499, rs3890745, rs2381416, rs2430561 в популяциях Северной Евразии. В целом, Северная Евразия отличается существенной вариабельностью исследованных генетических маркеров, как показано в настоящем исследовании и других работах [Степанов В.А. и др., 2002; Деренко М.В., Малярчук Б.А., 2010; Харьков В.Н. и др., 2012; Хуснутдинова Э.К. и др., 2014; Балановский О.П., 2015]. Данная вариабельность, вероятно, отражает постепенное расселение популяций человека от ареала происхождения (Африки), также может указывать на различие в распространенности ассоциированных МФЗ, в частности, иммунозависимых заболеваний.
Значения наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, оценка соответствия распределения генотипов в популяционных выборках равновесию Харди-Вайнберга представлены в таблице 3 и 4 приложения. Несоответствие равновесию Харди-Вайнберга (p 0,05) показано для 4,46% из всех представленных 1144 распределений: по маркеру rs2056626 у нивхов и кетов, rs2430561 у молдаван, украинцев, русских и эвенков, rs2070874 у украинцев, коми и узбеков, rs2243250 у украинцев и коми, rs144651842 в выборке нивхов, rs1801275 у бурятов, rs2227306 у алтайцев южных, rs1800872 у нивхов, rs1800896 у агульцев и хантов, rs6441286 у молдаван, агульцев, цезов и марийцев, rs3212227 у цезов, rs3790567 у марийцев и чукчей, rs1295685 и rs1800925 в выборке эвенков, rs9888739 в выборках эвенков и хантов, rs2546890 у тувинцев, rs3890745 у нивхов, rs2476601 у хантов, rs3821236 в выборках киргизов и молдаван, rs324015 у алтайцев южных, алтайцев северных и хакасов, rs4986790 у эвенков и агульцев, rs2569190 в выборке алтайцев южных, rs5744455 в выборках агульцев, алтайцев южных, удэгейцев, коряков и чукчей, rs7097397 у бурят и удэгейцев, rs2381416 и rs1837253в выборках бежтинцев и алтайцев южных, rs2104286 у алтайцев южных.
Не обнаружено накопления отклонений распределения генотипов от равновесного отдельно и по исследованным SNP, и в популяциях. Наблюдаемое несоответствие закону Харди-Вайнберга (p 0,05) может отражать особенности популяционно-генетических процессов в этнических группах, которые, возможно, связаны как и с функциональной значимостью изученных локусов, так и с характеристиками генетикo-демoграфическoй структуры пoпуляций [Хедрик Ф., 2003].
Генетическое разнообразие популяций оценивали с помощью средней по локусам гетерозиготности (табл. 7). Для сравнительного анализа были выбраны данные по исследованным SNP в мировых популяциях из проектов HGDP и «1000 геномов». В проекте HGDP данные были доступны для 27 локусов из 44 (rs1042713, rs2056626, rs1335532, rs2305480, rs907092, rs9303277, rs2070874, rs1801275, rs1805015, rs1800896, rs485499, rs6441286, rs3790567, rs20541, rs11150610, rs9888739, rs2546890, rs3890745, rs2476601, rs7574865, rs3821236, rs324015, rs4986790, rs1837253, rs13277113, rs2736340, rs231735).
Ожидаемая (наблюдаемая) гетерозиготность по 44 генетическим маркерам в популяциях Северной Евразии изменялась от 0,343 (0,333) у коряков до 0,407 (0,423) у узбеков. Анализ генетического разнообразия в регионах выявил низкие показатели усредненной ожидаемой гетерозиготности по 27 SNP для Африки (0,318), Америки (0,360) и Океании (0,344). Высокие значения получены для Средней Азии (0,390), Сибири (0,377) и Дальнего Востока (0,390). Исследование наблюдаемой гетерозиготности в регионах, также продемонстрировало постепенное увеличение генетического разнообразия от Африки в направлении к территории Северной Евразии. В целом, генетическое разнообразие отдельно в популяциях Северной Евразии по двум группам маркеров (44 и 27 SNP) соответствует уровню средней ожидаемой гетерозиготности в исследованных мировых популяциях.
Исследование корреляции генетического разнообразия с климато-географическими факторами
Распределение частот изученных SNP в популяциях проанализировано с помощью теста Юинса-Ваттерсона на нейтральность (табл. 6-9 приложения) и теста, опирающегося на степень генетической дифференциации популяций (FDIST). Следует отметить, что для 27 SNP отсутствовали данные по индивидуальным генотипам в 23 популяциях, выбранных из проекта HGDP.
Результаты теста Юинса-Ваттерсона свидетельствуют о действии направленного отбора в популяции по локусу, если значения наблюдаемой гомозиготности (Fo) в изученной выборке выше, чем в пороговой доле (0,01) случайных выборок генерированных при пермутации данных при данных частотах аллелей. Если Fo меньше, чем в пороговой доле случайных распределений, то генетический маркер находится под действием балансирующего отбора. Результаты теста Юнса-Ваттерсона в настоящем исследование выявили накопление высоких значений Fo по локусам rs1042713, rs1335532, rs2305480, rs2430561, rs907092, rs9303277, rs2070874, rs6441286, rs2546890, rs3890745, rs2569190, где Fo Fе и p 0,05 показано в 14, 8, 12, 8, 11, 13, 11, 10, 10, 9 и 15 из 69 популяционных выборок, соответственно. Данные маркеры относятся к генам ADRB2, CD58, GSDMB, IFNG, IKZF3, IL4, IL12A-AS1, LOC285626, MMEL1, TMCO6.
Выявлено 7 селективно нейтральных SNP (rs2104286, rs1801275, rs9888739, rs2476601, rs4986790, rs144651842 и rs2381416), где значения ожидаемой и наблюдаемой гомозиготности во всех изученных популяциях значимо не отличались. Накопление сигналов действия балансирующего отбора, согласно результатам данного теста, показано по следующим SNP: rs1042713 в гене ADRB2 в 9 популяциях, rs2305480 в гене GSDMB в 9 популяциях, rs907092 в гене IKZF3 в 10 популяциях, rs2546890 в гене LOC285626 в 11 популяциях, rs3890745 в гене MMEL1 в 10 популяциях. В целом, статистически значимые различия между Fо и Fе обнаружены для 13,01% из представленных 2645 распределений. В том числе, действие направленного отбора, которое приводит к увеличению числа гомозигот (Fо Fе), наблюдалось в 203 случаях, балансирующего – в 141 случае.
Интерпретация результатов теста FDIST: высокие значения Fst свидетельствуют о больших генетических различиях популяций по исследуемому локусу, что может быть связано с влиянием направленного отбора с разной интенсивностью в различных популяциях. В то время как низкое межпопуляционное генетическое разнообразие свидетельствует о действии балансирующего естественного отбора. Результаты данного теста представлены в таблице 10 приложения. Обнаружено, что примерно 50% изученных локусов находится под действием естественного отбора (рис. 20). При этом влияние направленного отбора показано для следующих SNP: rs2070874, rs2227284, rs2243250, rs1801275, rs3790567, rs11150610, rs9888739, rs2381416, rs13277113, rs2736340, которые относятся к генам IL4, IL4R, IL12RB2, ITGAM. Генетические маркеры rs2381416, rs13277113, rs2736340 расположены в межгенной области. Действие балансирующего отбора выявлено для локусов rs1042713, rs9303277, rs2104286, rs3212227, rs1800925, rs20541, rs2546890, rs3890745, rs2476601, rs7574865, rs324015, rs4986790, rs2569190, rs5744455 и rs1837253. Данные генетические маркеры относятся к генам ADRB2, IKZF3, IL2RA, IL12B, IL13, LOC285626, MMEL1, PTPN22, STAT4, STAT6, TLR4, TMCO6. Локус rs1837253 расположен в межгенной области.
Механизмы селекции аллелей исследованных маркеров в популяциях, возможно, связаны с функцией генов изученных SNP, показавших ассоциацию с иммунозависимыми фенотипами. Согласно литературным данным, гены иммунного ответа являются одними из наиболее частых объектов для выявления действия естественного отбора. Среди вероятных факторов отбора по данным генам следует выделить действие паразитарных инвазий и инфекций, оказывающих селективное давление на человека. В то же время в нашем исследовании показано, что вариабельность частот аллелей находится в большей зависимости от изменений климато-географических условий, чем от распространенности паразитарных и инфекционных заболеваний. Возможно, это связано с небольшим числом популяций, включенных в анализ корреляции исследуемых SNP c уровнем патогенности.
Таким образом, в данной работе обнаружены локусы, находящиеся под действием естественного отбора, влияющего на генетическое разнообразие и дифференциацию популяций. Направленный отбор, в отличие от балансирующего, характеризуется высокими показателями гомозиготности внутри популяции и межпопуляционного генетического разнообразия. Отбор против наиболее распространенного аллеля способствует уменьшению генетической гомозиготности и дифференциации популяций. Поэтому в настоящем исследовании сигналы направленного отбора против частого предкового аллеля по некоторым изученным SNP могут проявляться в виде сигнала балансирующего отбора.