Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1. Гистоны и структура хроматина эукариот . 9
1.2. Изменение первичной структуры гистонов в ходе эволюции 18
1..3. Тканеспецифичное проявление лизин-богатых гистонов 28
1.3.1. Лизин-богатый гистон, специфичный для эритроцитов птиц (гистон Н5) 31
1.3.2. Эритроцитспецифичная фракция лизин-богатого гистона рыб, амфибий и пресмыкающихся 35
1.3.2.1. Гистон Н5 рыб 35
1.3.2.2. Гистон Н5 пресмыкающихся 39
1.3.2.3. Гистон Н5 земноводных 41
1.3.3. Субфракционный спектр лизин-богатого гистона в сперматогенезе 42
1.3.3.1. Основные белки спермиев 44
I.4. Вариабельность строения гистоновых генов 48
1.4.1. Ген гистона Н5 курицы 52
Заключение 53
ГЛАВА 2. Материалы и методы 57
2.1. Животные 57
2.2. Выделение лизин-богатых гистонов . 62
2.3. Электрофорез в блоках полиакриламидного геля . 64
2.4. Количественное определение содержания отдельных фракций лизин-богатого гистона 65
2.5. Препаративный электрофорез 65
2.6. Расщепление лизин-богатых гистонов по остаткам отдельных аминокислот 67
2.6.1. Расщепление по остаткам тирозина . 67
2.6.2. Расщепление по остаткам метионина . 69
2.6.3. Расщепление по остаткам аспарагиновой кислоты 69
2.6.4. Расщепление по остаткам фенилаланина . 69
2.7. Неполное сукцинилирование лизин-богатых гистонов 69
2.7.1. Процедура неполного сукцинилирования . 69
2.7.2. Определение числа лизинов и суммарного числа аргининов и гистидинов в полипептидах . 70
2.7.3. Определение молекулярной длины (числа аминокислотных остатков) полипептида . 72
ГЛАВА 3. Результат 76
3.1. Сравнение первичных последовательностей глобулярного домена лизин-богатых гистонов . 76
3.2. Лизин-богатый гистон пресмыкающихся . 80
3.3. Лизин-богатый гистон земноводных . 87
3.4. Лизин-богатый гистон рыб 96
3.4.1. Лизин-богатый гистон, специфичный для семен ников тихоокеанской сельди 104
3.4.2. Вариабельность гистона Н5 рыб 109
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 116
4.1. Конвергентное происхождение гистона Н5 птиц игистона Н5 рыб 116
4.1.1. Сравнение скоростей изменения структуры гистонов НІ и Н5 в процессе эволюции . 122
4.2. Субфракционный состав лизин-богатого гистона и тип ткани 125
4.2.1. Относительная выраженность фракций Н1а и HIS и тип ткани 126
4.2.2. Соотношение фракций, различащихся строением концевых доменов, и тип ткани 128
4.3. Присутствие гистона Н5 и интенсивность обмена 132
Заключение 135
Вывода .# 139
Литература
- Гистоны и структура хроматина эукариот
- Эритроцитспецифичная фракция лизин-богатого гистона рыб, амфибий и пресмыкающихся
- Количественное определение содержания отдельных фракций лизин-богатого гистона
- Сравнение первичных последовательностей глобулярного домена лизин-богатых гистонов
Введение к работе
Актуальность исследования.
Гистоны являются необходимым компонентом хроматина эука-риот. О биологической важности этих белков говорит тот факт, что первичные последовательности гистона Н4 у коровы и гороха отличаются лишь двумя аминокислотными заменами (De Lange et al,, 1969). Работами последних лет показано, что гистоны Н2А, Н2В, НЗ и Н4 отвечают за нуклеосомный уровень упаковки ДНК, образуя ядро нуклеосомы (Felsenfeld, 1978). Богатый лизином гис-тон не входит в состав нуклеосомного ядра, а, по всей видимости, отвечает за наднуклеосомный уровень упаковки хроматина. Этот гистон подвержен значительно большим изменениям в ходе эволюции (Hunt, Dayhoff, 1982). В ряде работ было показано, что вариабельность этого белка у видов одной таксономической группы коррелирует не с геологическим возрастом таксона, а с его видовым многообразием (Бердников, 1978; Горель, Бердников, 1982). Высказана гипотеза, что изменения гистона НІ в ходе эволюционного процесса, влияя на компактность хроматина и тем самым на дифференциальную генную активность, связаны с процессом видообразования (Бердников,1978). Однако функциональная связь между изменением структуры лизин-богатых гистонов и компактностью хроматина к настоящему времени не установлена.
Как правило, лизин-богатый гистон животных представлен несколькими субфракциями, различающимися по первичной структуре (Rail, Cole, 1971). Соотношение субфракций может меняться в процессе индивидуального развития и тканевой дифференци-ровки, однако смысл этого явления остается неясным (Tsanev, 1980). Некоторые субфракции лизин-богатого гистона синтезируют-
ся только в определенных типах клеток. Так, в процессе эритро-поэза у птиц появляется специфичная для эритроцитов фракция лизин-богатого гистона - гистон Н5 (Hnilica, 1964). Процесс сперматогенеза также часто сопровождается появлением дополнительных фракций лизин-богатого гистона (Seyedin et ai., 1981). Процессы эритропоэза и сперматогенеза сопровождаются характерными изменениями структуры ядра, приводящими к видимому увеличению компактности хроматина ( Appels, Wells ,1972; Данилова,1982). По всей видимости, изучение тканеспецифичных вариантов лизин-богатого гистона может помочь связать изменения в субфракционном составе этих белков с особенностями строения хроматина.
У рыб, земноводных и пресмыкающихся последовательность стадий дифференцировки эритроцитов, по-видимому, сходна с таковой у птиц (Заварзин, 1953). Однако вопрос о распространении у этих животных эритроцитспецифичной фракции лизин-богатого гистона в настоящее время остается открытым. Данная работа посвящена следующим вопросам: а) в какой степени гистон Н5 необходим для функционирования ядерных эритроцитов; б) какие молекулярные особенности строения этого белка обусловливают его тканеспецифичность; в) каково происхождение этого белка: либо ген, кодирующий этот белок, был создан на заре эволюции позвоночных и затем передавался потомкам без существенных изменений, либо соответствующий ген создавался неоднократно из генов, кодирующих различные фракции гистона HI.
Цель и задачи исследования.
Основной задачей исследования было изучение эволюционных взаимоотношений гистонов HI и Н5 у позвоночных. Частные задачи включали в себя:
Поиск эритроцитспецифичных фракций лизин-богатого гистона у рыб, земноводных и рептилий.
Исследование степени гомологии гистона Н5 рыб и гистона Н5 птиц.
Анализ структурных особенностей эритроцитспецифических фракций лизин-богатого гистона.
Сравнение скоростей изменения структуры гистонов HI и Н5 в процессе эволюции.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В работе проведен анализ лизин-богатого гистона 58 видов рыб, амфибий и пресмыкающихся. Большинство видов изучено впервые. Проведено выделение этого белка у представителей практически всех отрядов земноводных и пресмыкающихся, имеющихся в современной фауне. Показано отсутствие у этих групп животных специфической для эритроцитов фракции лизин-богатого гистона. Впервые показано, что лизин-богатый гистон позвоночных представлен двумя молекулярными вариантами, различающимися по строению глобулярного домена. Проведен анализ структуры гистонов HI и Н5 рыб. Показано конвергентное происхождение гистона Н5 рыб и гистона Н5 птиц от различных фракций лизин-богатого гистона. Выдвинуто предположение, что главными отличиями гистона Н5 от других соматических вариантов гистона HI, обеспечивающими его суперкомпактизирующую функцию, являются высокое содержание остатков аргинина и повышенная доля основных аминокислот в /--и СООН-концевых доменах. Высказана гипотеза, что присутствие у животных гистона Н5 коррелирует с повышенной интенсивностью метаболизма. Работа вносит вклад в изучение роли гистонов в эволюционном процессе.
- 8 -Практическую ценность могут представлять: метод препаративного вьщеления электрофоретически чистых белков и упрощенная процедура выделения лизин-богатых гистонов из тканей, поз воляющая избежать протерлиза белков.
Гистоны и структура хроматина эукариот
Гистоны являются необходимым компонентом структуры хроматина всех эукариотических организмов. Многочисленные исследования, проведенные за последние 10 лет показали, что эти белки определяют нуклеосомный уровень упаковки ДНК в хроматине.
Впервые существование повторяющихся единиц в структуре хроматина эукариот было показано при мягкой обработке хроматина нуклеазами (Hewish, Burgoyne, 1973; Noll, 1976). Под электронным микроскопом такие повторяющиеся структуры видны как о сферические частицы диаметром около 100 А. Вначале их называли % -телами ( Olins, Olins, 1974), а позднее, нуклеосомами (Oudet et al., 1975).
В состав нуклеосомы входит сегмент ДНК длиной 200 - 250 пар оснований (п.о.), одна молекула гистона HI и октамерный комплекс гистонов, образованный четырьмя парами молекул Н2А, Н2В, НЗ и Н4. Номенклатура гистонов и их основные свойства приведены в табл.1. Универсальная для всех нуклеосом сердцевина (кор) состоит из центрально расположенного гистонового октаме-ра и ДНК длиной 146 пар оснований, образующей на поверхности частицы 1,75 витка левой суперспирали (Finch et al.,1977;butter, 1979; McChee, Felsenfeld, 1980). Основываясь на экспериментах по расщеплению микрококковой нуклеазой ДНК внутри нуклеосом, Доманский с соавторами ( Доманский и др., 1982) предложили детальную схему локализации гистонов вдоль цепи ДНК. Согласно этой модели, гистоны располагаются в следующем порядке: Н2А - Н2В - Н4 - НЗ - НЗ - Н4 - Н2В - Н2А; мононуклеосома состоит из центральной части, ДНК которой взаимодействует с тетра-мером гистонов (НЗ - H4)g и двух концевых участков, ДНК которых
связана с гистонами Н2А и Н2В. Модель эта близка к предложенной ранее другими авторами (Martinson, 1979; Belyavsky et al., 1980) и объясняет данные экспериментов по сшивке гистонов в хроматине ( Mirzabekov et al., 1978; Bonner, Stedman, 1979).
Нуклеосомное строение хроматина показано для всех изученных в этом отношении эукариотических организмов ( Woodcock et al., 1976; Tzanev, 1980).
Структура лизин-богатых гистонов значительно отличается от коровых гистонов. Эти белки имеют наибольший молекулярный вес среди гистонов (табл.1). Изучение конформации гистона НІ в растворах показало, что при рН 3 в отсутствии солей он не образует третичных структур. Увеличение ионной силы и рН приводит к скручиванию этого белка, однако образующийся глобулярный домен включает только часть полипептидной цепи ( Bradbury, 1975). Для гистона HI тимуса теленка глобулярный район включает остатки с 36 по 121 (Hartman et al., 1977). Данные, полученные при изучении гистона Н5 из эритроцитов курицы методами ЯМР и кругового дихроизма, показывают, что гистон Н5 состоит из трех структурных доменов: I) и -концевой области, богатой основными аминокислотными остатками (остатки I - 21); 2) компактного глобулярного домена (остатки 22 - 100); 3) длинной С-тер-минальной части, богатой основными аминокислотными остатками (остатки 101 - 185) (Aviles et al., 1978). Основываясь на гомологии расшифрованных первичных последовательностей, Ягучи (Yaguchi et al., 1979) определил границы этих доменов для других лизин-богатых гистонов (табл.2).
Обработка гистона Н5 курицы трипсином при высокой ионной силе приводит к образованию устойчивого пептида, соответствующего центральному домену молекулы (Aviles et al., 1978). Дан ные по трипсинолизу ядер тимуса теленка подтверждают существование трехдоменной структуры лизин-богатых гистонов и в составе хроматина ( Allan et al., 1980).
Лизин-богатые гистоны не входят в состав нуклеосомного ядра. Они первыми удаляются из хроматина при солевой или кислотной экстракции белков ( Wilhelm, Champagne, 1969) и наиболее доступны среди гистонов для гистоновых антител ( Goldblatt, Bustin, 1975). Во время обработки стафилококковой нуклеазой гистон HI освобождается с мономерных нуклеосом при уменьшении размера ДНК с 200 п.о. до 140 п.о. ( Shaw et al,, 1976; Varshavsky et al.,I976; Kornberg, 1977). Одновременно в растворе появляются фрагменты ДНК длиной около 35 п.о., связанные с гистоном HI ( Bakayev et al., 1977). Эти данные приводят к выводу, что лизин-богатый гистон связывается с лин-керными участками ДНК, соединяющими соседние нуклеосомы ( Kornberg, 1974; Noll, 1977; Noll, Kornberg, 1977). Дальнейшие исследования показали, что во время расщепления хроматина нук-леазами накапливаются фрагменты ДНК длиной 166 п.о. Последующее укорочение ДНК от 166 до 146 п.о. сопровождается освобождением гистона HI (Noll, Kornberg, 1977; Hayashi et al,, 1978; Klingholz, Stratling, 1982).
Рентгеноструктурный анализ показывает, что ДНК длиной в 166 п.о. образует два полных витка суперспирали, в которых два конца ДНК сближены вместе, в то время как 146 п.о. образуют 1,75 оборота ( Finch et al., 1977; Pinch, Clug, 1978). На основании электронно-микроскопических наблюдений за поведением хроматина с гистоном HI и в его отсутствие при различных ионных силах Тома с соавторами пришел к выводу, что гистон HI стабилизирует нуклеосому и располагается в области входа и вы - 14 хода ДОК из коровой частицы ( Thoma et al., 1979). Это позволило Тома предложить модель, в которой инвариантной частью нуклеосомного повтора является не 146 п.о. ДНК, соединенных с октамером гистонов, а полная 2-х витковая частица, содержащая 166 п.о. ДНК, октамер гистонов и гистон HI, "замыкающий" два витка нуклеосомной ДНК. Такую частицу авторы назвали хроматосо-мой (Thoma et al., 1979). В пользу этой модели также говорят следующие данные: I). Использование химических сшивающих реагентов различной длины указывает на тесный контакт гистона HI с коровыми гистонами ( Thomas, Romberg, 1975; Reudelhu-bert et al., 1980). 2). На нуклеосому приходится обычно одна молекула гистона HI ( Varshavskiy et al., 1976; Goodwin et al., 1977; Hayashi et al., 1978). 3). Гистон HI при низком отношении HI : ДНК присоединяется строго к суперспиральной ДНК (Singer, Singer, 1976).
Эритроцитспецифичная фракция лизин-богатого гистона рыб, амфибий и пресмыкающихся
Последовательность стадий дифференцировки от базофильно-го эритробласта до зрелых эритроцитов у птиц хорошо известна ( Williams, 1972; Coll, Ingram, 1978; Schlegel et al., 1980). По-видимому, сходная смена стадий дифференцировки клеток эритроидного ряда имеет место и у других позвоночных, имеющих ядерные эритроциты (Заварзин, 1953). В этой связи интересно проследить у них за изменением спектра лизин-богатого гистона в процессе эритропоэза.
Работы по изучению субфракционного состава лизин-богатого гистона различных тканей рыб, амфибий и пресмыкающихся наталкиваются на весьма существенные методические трудности. Во-первых, это значительно большая, чем у птиц, активность внутриклеточных протеаз ( Panyim et al., 1971a; Destree et al., 1975). Во-вторых, ограниченный протеолиз гистона HI часто дает фрагменты, сходные по электрофоретической подвижности с гистоном Н5 птиц ( Panyim et al., 1971а; Miki, Neelin, 1977a). В настоящее время, в связи с развитием методов молекулярной биологии и биохимии идет интенсивный пересмотр данных о наличии эритроцит-специфичной фракции лизин-богатого гистона у рыб, амфибий и пресмыкающихся.
Гистон Н5 рыб. Класс рыб объединяет наибольшее число видов позвоночных. Эта группа включает в себя совершенно различных животных - от миног и миксин до двоякодышащих рыб и камбал. Несмотря на все проблемы, связанные с происхождением отдельных групп, рыбы могут быть определены как водные пойкилотерм-ные животные, которые имеют в течение всей жизни жабры и, (если имеются) конечности в форме плавников ( Nelson, 1976). В таком виде эта группа в наши дни насчитывает около 19000 видов, объединяемых в 46 отрядов. Возможно, что действительное число видов может быть на 50% больше ( Nelson, 1976).
Впервые эритроцитспецифичная фракция лизин-богатого гистона была найдена у каранкса Caranx hippos (отр. Окунеобразные) ( Edwards, Hnilica, 1968). Аминокислотный состав этого белка существенно отличался от состава гистона Н5 птиц (табл.4). Впоследствии гистон Н5 был выделен из эритроцитов форели Salmo irideus (отр.Сельдеобразные). Аминокислотный состав этого белка (табл.4) и его постоянное количество при различных условиях выделения позволяют утверждать, что гистон Н5 форели не является продуктом деградации других ядерных белков ( Miki, Neelin, 1975). Межвидовое сравнение электрофоретической подвижности гистона Н5 лососевых рыб показывает, что структура этого белка подвержена изменениям в такой же степени, как и гистона HI (Заленский и др., 1981). Внутривидового полиморфизма по гистону Н5 у рыб этого семейства обнаружено не было (Заленский и др., 1981).
Следует заметить, что отр. Окунеобразные и отр. Сельдеобразные относятся к самым древним из отрядов костистых рыб -палеонтологические находки представителей этих отрядов относятся соответственно к верхнему мелу и среднему триасу (Данильченко, 1964). Наличие гистона Н5 у представителей этих отрядов говорит в пользу широкого распространения эритроцитспецифичной фракции лизин-богатого гистона у рыб. Действительно, вскоре был описан гистон Н5 карпа, принадлежащего к одному из наиболее богатых видами отряду Карпообразных ( Miki, Neelin, ,І977в). Содержание этого белка оказалось значительно более низким, чем у гуся, форели, окуня. В 1977 году Мики и Нилин провели сравнение лизин-богатого гистона из эритроцитов карпа Cyprinus carpio , чукучана Catostomus coiranersoni (отр. Карпообразные); краппи Pomoxis nigromaculatus , окуня Perca flavescens (отр. Окунеобразные) и форели Salmo gairdnerii (отр. Сельдеобразные) . Выделение белка проводилось в условиях, практически исключающих протеолиз. Гистоны HI и Н5 разделялись катионооб-менной и вытеснительной хроматографией. Белок, аналогичный по хроматографическим свойствам гистону Н5 птиц, был выделен из зрелых эритроцитов карпа, форели , окуня и краппи, однако в эритроцитах чукучана его не оказалось. Значительные различия в количественной выраженности гистона Н5 у исследованных рыб, включая его "кажущееся" отсутствие в эритроцитах чукучана, привели авторов к выводу, что типичный гистон Н5 не существенен для функционирования или развития ядерных эритроцитов ( Miki, Neelin, 1977 с). Для объяснения вариабельности количественного содержания гистона Н5 Мики и Нилин предположили, что различные субфракции лизин-богатого гистона выполняют сходные функции в различных условиях; гистон Н5 представляет собой экстремальную адаптацию к высокоспециализированным условиям ядерных эритроцитов, тогда как у видов рыб с низким уровнем гистона Н5 функции, выполняемые этим белком, продолжает осуществлять гистон HI (Miki, Neelin, 1977 в).
Сравнение аминокислотного состава гистона Н5 различных рыб (табл.4) показывает, что этот белок значительно отличается от гистона Н5 птиц. Обычно в гистоне Н5 рыб больше остатков треонина, но меньше серина, глицина, аргинина и гистидина, Кроме того, гистон Н5 значительно различается у разных видов рыб, особенно в отношении остатков серина, аргинина и лизина. Для установления гомологии гистона Н5 птиц и гистона Н5 рыб применялся радиоиммунный метод (Goetz et al., 1978). В этой работе исследовался лизин-богатый гистон из эритроцитов следующих видов рыб: акулы Musteius canis (отр. Ламнообразные); ската
- 39 Raja erinacea (отр. Скатообразные); скала Stenotonaus chrysops , таутоги Tautoga onitis (отр. Окунеобразные); морского петуха Prionotus caroiinas (отр. Скорпенообраз-ные) и рыбы-жабы Opsanus tao (отр. Батрахообразные). У всех исследованных рыб электрофорез в полиакриламидном геле показал присутствие фракции, примерно соответствующей по подвижности гистону Н5 курицы. Оказалось, что суммарный препарат гистонов из эритроцитов рыб может конкурировать за антитела к гистону Н5 цыпленка с суммарным гистоном курицы, меченным и содержащим 17% гистона Н5. Авторы делают вывод, что дивергенция гистона Н5 от других фракций лизин-богатого гистона произошла на заре эволюции позвоночных и этот белок сохранялся в эволюции ядерных эритроцитов ( Goetz et al.t 1978). 1.3.2.2. Гистон Н5 пресмыкающихся. Имеется только одно указание на существование эритроцитспецифичной фракции лизин-богатого гистона у пресмыкающихся. При сравнении лизин богатого гистона из ядер эритроцитов и печени морской черепахи Ghelonia mydas Тсай и Хнилика обнаружили, что из двух фракций лизин-богатого гистона эритроцитов (Р 1а и Р їв) в печени присутствует только Р la ( Tsai, Hnilica ,1975). Хотя эти авторы говорят о гомологии гистона Н5 курицы и фракции Р їв, аминокислотные составы этих белков резко различаются (табл.5). В более поздней работе в ядрах эритроцитов и печени пресноводной черепахи Pseudomys scriptans elegans был найден минорный компонент лизин-богатого гистона (фракция HI ), отличающийся по молекулярному весу и аминокислотному составу от остальных фракций ( Rutledge et al#, 1981).
Количественное определение содержания отдельных фракций лизин-богатого гистона
Препаративное разделение белков проводили в блоках поли-акриламидного геля, используемых для аналитического электрофореза. Однако в этом случае шаблон позволял получить один общий старт на весь блок.
После электрофореза гель окрашивали 0,1% раствором Кумас-си R -250 в 7%-ной уксусной кислоте в течение 20 - 10 минут. Как только гель окрашивался с поверхности, полосу, содержащую нужную гистоновую фракцию, вырезали. Одновременно вырезалась полоса геля шириной 2 см, не содержащая белка. Полосы вымачивали в растворе 0,9 М уксусной кислоты, содержащей 4% ТЕМВДа и 8 М мочевины в течение 1-2 часов.
Элгоцию белка из геля вели в разборной камере, изображенной на рис.6. Полоску геля с белком (2) укладывали на стекло (I) на расстоянии I - 2 см от геля, не содержащего белок (3). С боковых сторон укладывали изолирующие прокладки их полихлорвинилового шланга, вымоченные в толуоле (4). Сверху накладывали второе стекло и собранную таким образом камеру скрепляли тефлоновими зажимами. Полость между гелями (5) заполняли раствором 4%-ного ТЕМВДа и 0,9 М уксусной кислоты, прокалывая изолирующие прокладки иглой шприца. Камеру помещали в аппарат для электрофореза (Бердников, Горель, 1975).
В процессе электрофореза белок концентрировался у задней границы медленно мигрирующих ионов ТЕМЕД + в узкую зону, видимую глазом. После вхождения этой зоны в полость между гелями электрофорез прекращался. Прокладки камеры прокалывали иглами и жидкость из камеры извлекали при помощи шприца. Полученный раствор подкисляли концентрированной серной кислотой до I N и осаждали белок добавлением б объемов этанола. Осадок дважды промывали этанолом и хранили под этанолом. Результат препаративного разделения фракций лизин-богатого гистона из эритроцитов язя показан на рис.7. Расщепление лизин-богатых гистонов по остаткам отдельных аминокислот. 2.6.1. Расщепление по остаткам тирозина.
Для расщепления по остаткам тирозина к лизин-богатому гис-тону (1-3 мг/мл), растворенному в 0,9 М уксусной кислоте, содержащей Ш мочевину и 10% сахарозу, непосредственно перед нанесением на гель для электрофореза добавляли N -бромсукцини-мид до конечной концентрации I мг/мл ( Sherod et al#, 1974). N -бромсукцинимид позволяет производить расщепление по остаткам тирозина, не элюируя белок из геля. Для этого после разделения белка электрофорезом в первом направлении, полоска геля, содержащая определенную фракцию лизин-богатого гистона, вымачивалась 10 минут в растворе, содержащем 0,1 М уксусную кислоту, 8 М мочевину и 3 мг/мл N -бромсукцинимида, после чего осуществлялся электрофорез во втором направлении (Свинар чук и др., 1982).
Для расщепления по остаткам метионина электрофоретически чистые фракции лизин-богатого гистона (1-3 мг/мл) 2 часа обрабатывались бромцианом (2 мг/мл) в 0,1 М соляной кислоте при 25С ( Gross, 1967).
Для селективного расщепления по остаткам фенилаланина лизин-богатый гистон в течение 10 минут при 37 обрабатывали об -химотрипсином в 0,05 М трис- неї буфере, рН 8,3. Соотношение фермент - белок составляло I : 200 ( Brandbury et al., 1975). Реакцию останавливали добавлением уксусной кислоты до концентрации 0,9 М.
Этот метод применяется для определения числа остатков лизина, суммарного числа остатков аргинина и гистидина, а также молекулярной длины полипептидов (длины полипептида, выраженной в числе аминокислотных остатков). 2.7.1. Процедура неполного сукцинилирования.
Исследуемые белки предварительно разделяли в блоке 15%-ного полиакриламидного геля, как описано выше. После прокрашивания полоску геля, содержащую исследуемый белок, в течение часа вымачивали в растворе 3 М ацетата натрия и, убрав фильт -ровальной бумагой избыток влаги, помещали в смесь диоксан-хлороформ (2 : I), содержащую 2,5 мг/мл янтарного ангидрида. Через 15 - 20 минут кусочек геля помещали на старт блока поли-акриламидного геля, в стартовые углубления добавляли по 25 мкл З М ацетата натрия и подвергали электрофорезу в системе уксусная кислота - мочевина. Время электрофореза - 30 - 40 часов (в зависимости от подвижности полипептида), градиент напряжения - 20 В/см. Определение числа лизинов и суммарного числа аргининов и гистидинов в полипептидах.
Электрофоретическая подвижность белка в присутствии уксусной кислоты и мочевины определяется числом положительных зарядов, принадлежащих остаткам лизина, аргинина, гистидина и и -концевой аїлиногруппе. В ходе реакции сукцинилирования модифицируются f -аминогруппы остатков лизина и об -аминогруппа N -концевой аминокислоты. При этом присоединение одного остатка янтарной кислоты приводит в 0,9 М уксусной кислоте к уменьшению положительного заряда полипептида на единицу.
Сравнение первичных последовательностей глобулярного домена лизин-богатых гистонов
Центральный, наиболее богатый гидрофобными аминокислотными остатками домен имеет глобулярную структуру, в то время как богатые основными остатками ин2""и СООН-концевые участки не образуют третичных структур ( Aviles et al., 1978; Yaguchi et al., 1979).
Сравнение расшифрованных к настоящему времени последовательностей лизин-богатых гистонов показывает, что вариабель -ность структуры НН2-и СООН-концевых доменов чрезвычайно высока и установление гомологии этих районов весьма затруднительно. Структура центральной, глобулярной области гораздо более консервативна (Hunt, Dayhoff, 1982; Levy et al., 1982). Выравнивание первичных последовательнстей этого домена у различных животных проведено Леви с соавторами (рис.2) ( bevy et al., 1982). Из рисунка 2 видно, что этот район лизин-богатых гистонов практически не содержит вставок или выпадений аминокислотных остатков. Максимальное число таких различий (вставок или выпадений) при сравнении любых двух последовательностей не превышает трех. Используя это выравнивание, мы построили матрицу аминокислотных различий глобулярных районов (табл.8).
При построении этой матрицы в равной степени учитывались различия типа аминокислотных замен и типа вставок и выпадений. Так как не все аминокислотные последовательности глобулярных районов полностью расшифрованы, то степень различия между последовательностями мы выражали в процентах. Основанием для этого приема служит равномерность скорости аминокислотных за мен в отдельных районах глобулярного домена ( bevy et ai., 1982).
Такое сравнение позволяет разделить лизин-богатые гисто-ны позвоночных на две четко различающиеся группы. К первой группе следует отнести гистон Н5 птиц и гистон HI0 млекопитающих, ко второй - остальные изученные фракции лизин-богатого гистона позвоночных.
Среднее число различий между членами первой группы составляет 17% (среднеквадратичное отклонение +6,4); между членами второй группы -17,5 (среднеквадратичное отклонение 6,7). Между членами этих групп среднее число различий равняется 60,2% (среднеквадратичное отклонение 8,2). Мы назвали эти два типа лизин-богатых гистонов Н1а и HI соответственно (Свинарчук, ердников, 1983).
Глобулярная область гистона Н5 птиц (для которой известна вся первичная последовательность) содержит три остатка ти-розина по сравнению с одним остатком тирозина в гистона HI (рис.2). Это различие легко установить при электрофорезе продуктов обработки белка N -бромсукцинимидом, расщепляющим гистоны по остатками тирозина. При неполном расщеплении гистона Н5 образуется три характерных фрагмента, несущих СООН-конец исходной молекулы, в то время как при сходной обработке гистона Н13возникает только один такой фрагмент (рис.II). Другие фрагменты, образующиеся после обработки лизин-богатых гистонов ж -бромсукцинимидом, имеют меньшую длину, меньшую долю основных аминокислот и на электрофореграмме обычно не видны. Мы использовали этот прием для поиска в составе лизин-богатого гистона фракций, гомологичных гистону Н5 птиц.
В морфологическом отношении птицы весьма близки к рептилиям, и систематики включают тех и других в одну группу Sauro-psida (Дементьев, 1964). Поэтому поиск фракции лизин-богатого гистона - предка гистона Н5 птиц - мы начали именно с пресмыкающихся. Лизин-богатый гистон был выделен из крови, печени, сердца, слизистой кишечника и мозга прыткой ящерицы, степной агамы (отр. Ящерицы); средиземноморской черепахи (отр. Черепахи); узорчатого полоза, обыкновенного щитомордника (отр. Змеи) (табл.7). На рис.12 приведены результаты электрофореза лизин-богатого гистона из эритроцитов этих рептилий. Видно, что гистон HI состоит из нескольких субфракций, причем самая быстрая субфракция (НІа) у всех видов имеет близкую электрофорети-ческую подвижность.
Обработка N -бромсукцинимидом гистона HI рептилий показала, что по числу и расположению остатков тирозина фракция Н1а рептилий сходна с гистоном Н5 птиц (рис.13). Остальные фракции гистона HI пресмыкающихся в этом отношении близки гистону HIS птиц и расшифрованным к настоящему времени гистонам HI млекопитающих (кроме гистона HI0) и рыб ( Von Holt et al., 1979).
Возникает вопрос: не является ли фракция Н1а аналогичной по функции гистону Н5 птиц? Если ее функция такая же, как и у гистона Н5 птиц, то следует ожидать повышенного содержания этого белка в эритроцитах.