Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Структура генома высших растений 7
1.1.1. Размер генома высших растений 8
1.1.2. Состав генома растений 10
1.1.2.1. Уникальные последовательности 12
1.1.2.2. Повторяющиеся последовательности 15
1.1.2.2.1. Сателлитная, мини-и микросателлитная ДНК 15
1.1.2.2.2. Мобильные генетические элементы 18
1.2. Картирование геномов растений 25
1.2.1. Генетические карты 25
1.2.2. Физические карты 27
1.2.3. Интеграция карт 29
1.3. Методы выявления полиморфизма ДНК 32
1.3.1. Случайные маркеры 33
13.2. Специфичные маркеры 36
1.4. Генетические особенности представителей семейства Бобовые (Fabaceae) 44
1.4.1. Выраженная синтенность геномов бобовых 45
1.4.2. Горох посевной: особенности объекта и состояние исследований 48
Глава 2. Материалы и методы 57
2.1. Исходный материал 57
2.2. Выделение геномной ДНК гороха 60
2.3. Полимеразная цепная реакция 61
2.4. Обработка ПЦР-фрагментов эндонуклеазами рестрикции 61
2.5. Фракционирование фрагментов ДНК 62
2.6. Клонирование и секвенирование ПЦР-фрагментов 63
2.7. Обработка результатов генетического анализа 63
2.8. Поиск гомологичных последовательностей в базах данных 67
Глава 3. Результаты и обсуждение 68
3.1. ПЦР-амилификация фрагментов генов гороха 68
3.2. Клонирование, секвенирование и анализ последовательностей фрагментов генома гороха 75
3.3. Поиск полиморфизма внутри фрагментов генов гороха среди набора контрастных линий и сортов 76
3.4. Дополнительный анализ нуклеотидного полиморфизма внутри амплифицированных генных фрагментов среди линий, сортов и различных видов гороха 79
3.5. Использование CAPS-полиморфизма для локализации генов на карте групп сцепления гороха 84
3.6. Сопоставление данных по картированию генов с информацией о положении их ортологов на физической карте M.truncatula 98
Заключение 102
Выводы 105
Список литературы 106
Приложение 118
Введение к работе
Актуальность проблемы. Открытие методов, позволяющих обнаружить различия между объектами непосредственно в генетическом материале, дало большой скачок в картировании геномов растений. Все ДНК-маркеры обладают существенными преимуществами по сравнению с морфологическими маркерами: они позволяют выявлять полиморфизм в любом участке генома, дают возможность вести анализ по неограниченному числу локусов в одном скрещивании, а различные полиморфные состояния маркеров обычно не оказывают влияния на жизнеспособность организмов [Малышев и Картель, 1997; Saliba-Colombani et al, 2000].
Приоритетным направлением в картировании геномов высших растений сегодня является разработка надежных методов для сопряжения реком-бинационных и физических карт, а также поиск новых универсальных генетических маркеров, позволяющих проводить сравнительное картирование геномов различных видов. Среди нескольких типов молекулярных маркеров, подходящих для этих целей, одними из самых удобных и надежных являются CAPS-маркеры, выявляющие полиморфизм по наличию сайтов рестрикции внутри последовательностей уникальных генов растений [Komeczny and Ausubel, 1993; Weeden et al., 1999; Brauner et al, 2002].
Метод CAPS (ПЦР-ПДРФ) успешно применяется в современных генетических исследованиях. В первую очередь он используется для насыщения генетических карт надежными молекулярными маркерами с точно известной локализацией, относительно которых можно проводить картирование новых генов на широком круге скрещиваний. Впервые система таких маркеров была предложена для Arabidopsis ihaliana (L.) Heynh. [Komeczny and Ausubel, 1993; Jarvis et al., 1994], и благодаря ее использованию картирование мутантных локусов стало простой и несложной процедурой [Baumbusch et al., 2001].
Использование внутригенного полиморфизма в картировании дает возможность не только насыщать карты надежными молекулярными маркерами, но и сопоставлять положения генов у различных видов растений. Сравнительное картирование представляет интерес не только как фундамен- тальная задача геномики, но и как необходимое подспорье для работ по позиционному клонированию генов у растений, геном которых не секвени-рован. В частности, при изучении новых мутаций сегодня широко применяется метод поиска генов-кандидатов [Borisov et al., 2003; Hecht et al., 2005; Tattersall et al., 2005]. По литературным данным исследователи находят потенциальные гомологи исследуемого гена, изученные у модельных объектов и имеющие сходные функции. Прежде чем гены-кандидаты проверяются на соответствие исследуемому локусу, среди них отбираются те, которые, согласно данным сравнительного картирования между двумя видами, располагаются в гомологичных районах хромосом. Такой подход позволяет во много раз сокращать объем работы при клонировании новых генов и дает возможность активно использовать результаты секвенирования геномов модельных объектов при работе с хозяйственно важными видами растений [Devos and Gale, 2000; Borisov et al., 2003; Choi et al., 2004b; Gonzales et al, 2005].
В случае гороха посевного (Pisum sativum L.), важного объекта генетики растений, вышеупомянутые направления только начинают развиваться. Горох активно используется как модель для изучения генетического контроля ряда комплексных процессов, в первую очередь процессов симбиогенеза с клубеньковыми бактериями [Борисов и др., 1998; Borisov et al., 2003; Greshoff, 2005] и формирования сложного листа [Tattersall et al, 2005]. Несмотря на постоянную необходимость локализации новых генов гороха, до сих пор не создана полноценная система надежных маркерных локусов, пригодных для широкого использования в генетическом анализе и для сопоставления генетической карты гороха с физическими картами других бобовых, в первую очередь люцерны Medicago truncatula Gaertn., геном которой будет секвенирован в 2007 г. [VandenBosch and Stacey, 2003]. В ряде работ уже составлены подробные карты групп сцепления гороха на основе маркеров, выявляемых с помощью произвольных праймеров [Weeden et al, 1998; Rameau et al., 1998; Irzikowska et al., 2001; Чегамирза, 2004], а также локализовано несколько десятков генов с помощью CAPS-метода [Brauner et al., 2002; Grusak et al., 2004; Kalo et al., 2004; Hecht et a]., 2005], однако область применения таких маркерных систем пока ограничена либо в силу малой воспроизводимости методов случайного ампликона, либо из-за отсутствия данных о полиморфизме маркеров среди большинства важнейших линий и сортов. Кроме того, количество известных CAPS-маркеров, выявляющих внутригенный полиморфизм у гороха, пока невелико. Для многих генов гороха с известной последовательностью, доступных в базе GenBank, отсутствует информация о локализации в геноме и, что не менее важно, о внутривидовой изменчивости. Микросателлитные маркеры, большое число которых описано в работе [Loridon et al., 2005], будучи достаточно надежными и высоко полиморфными, мало пригодны для сопоставления генетической карты гороха с физической картой люцерны из-за недостаточного консерватизма большинства сайтов отжига праймеров.
Таким образом, существует необходимость локализации генов гороха с известной последовательностью и создания надежных молекулярных маркеров на их основе. Кроме того, возможность успешного использования маркерных локусов определяется наличием информации об их полиморфизме у репрезентативного набора линий и сортов, и любая работа по получению такой информации сегодня является актуальной и востребованной,
Цель настоящей работы - построить генетическую карту для гороха посевного на основе молекулярных маркеров типа CAPS, выявляющих полиморфизм в последовательностях уникальных генов. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
Амплифицировать фрагменты ряда уникальных генов гороха посевного с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР);
Выявить полиморфизм в амплифицированных последовательностях среди сортов и линий гороха;
Локализовать полиморфные генные последовательности на карте групп сцепления в ходе генетического анализа популяций гибридов F2 от скрещиваний (СЫ115 х WL1238) и (Флагман х WL1238);
Определить наиболее вероятное положение ортологичных локусов на физической карте генома Medicago truncatula и сравнить полученные данные с результатами генетического картирования у гороха.
link1 Структура генома высших растений link1
Высшие растения, будучи одними из наиболее высокоорганизованных организмов на Земле, обладают геномом значительной сложности. Размер растительного генома сильно варьирует, однако по содержанию генов и других функциональных элементов его можно сопоставлять с хорошо изученными геномами позвоночных, в том числе человека [The Arabidopsis Genome Initiative, 2000; Lander et al, 2001]. Изучение генетического аппарата растений началось с описания цитологических характеристик кариотипа, чему в значительной мере способствовало наличие множества видов с крупными, немногочисленными и ясно различимыми хромосомами. Уже на данном этапе (в частности, при использовании С- и R-окрашивания) стало очевидным неравномерное распределение различных параметров хроматина по длине хромосом, вследствие чего были выдвинуты предположения о наличии в геноме областей с характерными структурными и функциональными особенностями - в первую очередь центромер, теломер, ядрышковых организаторов (ЯОР), а также эу- и гетерохроматиновых районов [Прокофьева-Бельговская, 1986].
Современные представления об информационной составляющей генома построены в первую очередь на анализе полных последовательностей ядерной ДНК модельных объектов - резуховидки Таля Arabidopsis thaliana (L.) Heyhn. [The Arabidopsis Genome Initiative, 2000] и риса Oryza sativa L. [Goff et al., 2002; Yu et al., 2002] (кроме того, в настоящее время идет определение последовательностей геномов однолетней люцерны Medicago truncatula Gaertn. и лядвенца Lotus japonicus L. [VandenBosch and Stacey, 2003; Udvardi et al., 2005], а также кукурузы Zea mays L. [Whitelaw et ah, 2003] и ряда других видов высших растений).
Исходный материал
В работе были использованы сорта, мутанты и маркерные линии гороха посевного (Pisum sativum L.), а также линии гороха полевого (Pisum. sativum ssp. arvense, линия JI2423), абиссинского подвида гороха (P.sativum ssp. abyssinicum, линия JI2), видов P.elatius (линия Л.64) и P.humile (линия Л1794) из коллекции центра Джона Иннеса (Норвич, Великобритания). Описания линий приведены в таблице 1.
Для получения картирующих популяций скрещивали мутант "СЫ115" и сорт "Флагман" с маркерной линией "WL1238". Две популяции F2 (WL1238 х Chi 115) и (WL1238 х Флагман), состоящие из 223 и 147 индивидуальных растений, соответственно, получили путем самоопыления гибридов первого поколения. Растения всех поколений выращивали в полевых условиях.
ПЦР-амилификация фрагментов генов гороха
Среди литературных данных и в базе Genbank был проведен поиск генов гороха для подбора праймеров и постановки ПЦР-амплификации. Поскольку обязательным условием дальнейшего генетического картирования ТЩР-фрагментов являлась возможность выявить полиморфизм их последовательностей, приоритет получали те гены, в состав которых входили протяженные интроны, окруженные более консервативными экзонными участками. В ходе отбора было выявлено 62 гена, удовлетворяющих указанным критериям.
Похожие диссертации на Картирование и молекулярно-генетический анализ генов гороха (Pisum sativum L. )
