Введение к работе
Актуальность проблемы. Эра интенсивного картирования хромосом млекопитающих началась более 30-ти лет назад с открытия явления сегрегации хромосом в межвидовых гибридах соматических клеток. Специальные наборы клеточных гибридов, названные панелями, позволяли картировать на хромосомы маркеры различных типов, проявлявшие межвидовой полиморфизм, а гибриды с хромосомными перестройками использовались для субхромосомной локализации генов.
На сегодняшний день свинья домашняя (Sus scrofa domestica L.) является одним из наиболее интенсивно картируемых видов. В отличие от цитогенетических карт большинства вовлеченных в картирование видов, которые были построены на основе панелей гибридов соматических клеток, к началу данного исследования основные локализации на хромосомы свиньи были сделаны с помощью гибридизации in situ (Yerle et al., 1995). Это было связано с тем, что имеющиеся соматические гибриды свиньи с традиционными партнерами -мышью и китайским хомячком - имели нестабильный хромосомный состав и содержали множественные хромосомные перестройки (Rettenberger et al., 1S94; Yerle et al., 1996; Zijlstra et al., 1996).
Решение проблемы было найдено в применении современных методов молекулярной цитогенетики для описания перестроек в гибридах свинья - грызуны, и сегодня более половины генов нанесено на цитогенетическую карту свиньи с помощью гибридов соматических клеток. Однако, для большинства из них локализации следует рассматривать как предварительные, т.к. они получены на одной панели гибридных клеток (Yerle et al., 1996). Кроме того, по-видимому, не все присутствующие перестройки хромосомного материала свиньи, особенно небольшого размера, были выявлены в силу особенностей метода обратной гибридизации in situ, использовавшейся для идентификации хромосом в этой панели. Поэтому по-прежнему существует необходимость, во-первых, в создании более стабильных и менее склонных к перестройкам клеточных гибридов свиньи, и, во-вторых, в более тонких и точных методах анализа хромосомных перестроек в гибридах.
В лаборатории генетических основ онтогенеза был получен новый тип клеточных гибридов свинья-американская норка, имеющих достаточно стабильный хромосомный состав и
небольшое число перестроек и фрагментации хромосом (Астахова и др., 1994; Zhdanova et al., 1994). Среди полученных гибридов выделялся малохромосомный класс, позволивший создать уникальный набор клеточных линий, содержащих единственную хромосому свиньи (Zhdanova et al., 1996). Он перспективен для работ по картированию, получению хромосомо-специфических библиотек свиньи или позиционному клонированию. Одной из возможностей использования таких линий, надежно охарактеризованных цитогенетическими и молекулярными методами, также является проведение радиационного картирования отдельных хромосом свиньи или их районов (Сох et al., 1990; James et al., 1994). Этот подход базируется на создании панелей гибридных клонов (РГ панелей), полученных от слияния радиационно-облученных донорских клеточных линий с необлученными клетками реципиента.
В последние годы метод межвидовой соматической гибридизации получил буквально «второе рождение» в связи с активным вовлечением в картирование радиационных клеточных гибридов. Метод позволяет проводить локализации с точностью до нескольких сот п.н., не требуя внутривидового полиморфизма маркеров и, таким образом, обеспечивая интеграцию в единую карту высокополиморфных и эволюционно-консервативных маркеров и, в итоге, создание единой карты вида.
К началу настоящего исследования РГ панели существовали только для человека и мыши (Sefton et al., 1992; Hudson et al., 1995; Gyapay et al., 1996). Геномная РГ панель свиньи, как и нескольких других видов млекопитающих, была создана позднее (Yerle et al., 1998). Однако на нее, как и на генетическую карту свиньи, до сих пор нанесены в основном гипервариабельные маркеры. Создание таких «микросателлитных» карт важно для планирования маркер-опосредованной селекции, но оно не позволяет проводить сравнительное картирование. Таким образом, насыщение геномной карты свиньи генами, определение их порядка в хромосомах и установление минимальных эволюционно-консервативных районов геномов млекопитающих сегодня является наиболее актуальной задачей.
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлось расширение области применения межвидовых гибридов соматических клеток для картирования хромосом свиньи.
Непосредственной задачей исследования было пополнение коллекции монохромосомных клеточных гибридов свиньи, развитие способов идентификации генетического материала картируемого вида в клеточных гибридах, а также создание панели РГ клонов для картирования у свиньи маркеров из высоко консервативного района, гомеологичного 11pter-q1.3 району генома человека.
Для достижения цели были поставлены следующие конкретные задачи:
1). Получить клеточную гибридную линию, содержащую единственную хромосому свиньи на фоне хромосом норки, и провести ее полную цитогенетическую характеристику.
2). Провести идентификацию генетического материала свиньи в гибридном клоне SV36, используя микродиссекцию перестроенных хромосом, создание пейнтинг проб и их супрессионную гибридизацию на хромосомы свиньи. Использовать охарактеризованный клон для региональной локализации нескольких генов и микросателлитов свиньи.
3). Получить радиационную гибридную панель клонов путем слияния облученных клеток гибридной линии, содержащей одну хромосому 2 свиньи, с клетками китайского хомячка.
4). Охарактеризовать полученную РГ панель методами молекулярной цитогенетики для выявления закономерностей сохранения фрагментов хромосомного материала донора в РГ линиях. Отобрать клоны с небольшим числом фрагментов хромосомы 2 свиньи для субхромосомного картирования.
5). С помощью полученной панели локализовать на радиационную карту р плеча хромосомы 2 свиньи ряд микросателлитных и генных маркеров. Провести сравнение генетической, радиационной и цитогенетической карт этого района генома свиньи.
6). Провести сравнительный анализ порядка генов в исследуемом районе генома свиньи и гомеологичном районе генома человека.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые получена клеточная линия, содержащая единственную хромосому свиньи 9 на фоне хромосом норки и пополнившая уникальную коллекцию монохромосомных клеточных гибридов свиньи. Линия охарактеризована цитогенетически и с помощью ПЦР-маркера.
Впервые для идентификации хромосомных перестроек в клеточных гибридах использован метод микродиссекции
перестроенных хромосом с последующей обратной in situ гибридизацей ПЦР продукта диссектированного материала на хромосомы свиньи, что позволило провести региональную локализацию генов ТК1 и UMPH2 и одного микросателлита в 12pter-p1.5 район генома свиньи.
Впервые создана РГ600о панель для физического картирования хромосомы 2 свиньи, состоящая из 118 РГ клонов. Панель охарактеризована цитогенетически с помощью методов гибридизации in situ с суммарной ДНК свиньи и норки, а также обратной гибридизации in situ. Отобраны 3 клона с надежно идентифицированными фрагментами хромосомы 2 свиньи для регионального картирования.
Впервые построена РГ карта р плеча хромосомы 2 свиньи, включающая 15 микросателлитов и 5 генов: CAPN1, FSHB, LDHA, MYOD1 и РТН, и проведено сравнение порядка генов в этом районе и гомеологичном районе генома человека 11pter-q1.3. Установлена идентичность порядка генов с инверсией относительно теломеры и изменением положения центромеры.
Практическая ценность построения радиационой карты, упорядочивающей микросателлитные и генные маркеры, состоит в повышении возможностей позиционного клонирования экономически важных локусов и оптимизации селекционно-генетических работ. Картирование генов LDHA, CAPN1, FSHB, MYOD1 и РТН, дефекты которых вызывают тяжелые наследственные заболевания, связанные с нарушениями обмена веществ, репродуктивных функций и злокачественными новообразованиями у человека имеет большое экономическое значение и у сельскохозяйственных животных.
Материалы диссертации используются при чтении учебного курса «Цитогенетика» в Новосибирском государственном университете.
Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на 12-ом Европейском коллоквиуме по цитогенетике домашних животных (Сарагоса, Испания, 1996), на 10-ом Североамериканском коллоквиуме по генетическому картированию и цитогенетике человека и домашних животных (Апалачикола, США, 1997), на 6-ой Международной конференции по геному человека и животных (Сан-Диего, США, 1998), на 2-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000), на 8-ой Международной конференции по
геному человека и животных (Сан-Диего, США, 2000), на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН.
По материалам диссертации опубликовано 10 работ в отечественной и зарубежной печати.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18-тью рисунками и содержите таблиц.