Введение к работе
Известно, что аномалии кариотипа являются частой патологией в пренатальном и постнатальном периодах развития человека. Спонтанным абортом заканчиваются до 15 всех зарегистрированных беременностей. После того как в 1961 г. впервые было обнаружено наличие аномального кариотипа (триплоидия) в клетках мацерированного спонтанного абортуса (Penrose and Delhanty, 1961), было опубликовано большое количество работ по цитогене-тическому исследованию спонтанных абортусов человека (Kajll et al.,1973; Boue and Boue.1976: Кулиев. 1975; Hassold et al.,1980. 1983; Warburgton.1980,1987). Отмечено, что 50-60% спонтанных абортусов имеют аберрантный набор хромосом, с самого начала исследования этой проблемы стало ясно, что распределение типов аномалий кариотипа среди спонтанных абортусов значительно отличается от того, которое определено различными авторами при цитогенетическом исследовании десятков тысяч новорожденных детей. Используя данные цитогенетического исследования более 5 тысяч спонтанных абортусов было обнаружено следующее соотношение основных типов хромосомных аномалий: моносомня X - 15!?. трисомии аутосом - 52%, триплоидия - 2055. тетраплоидия - 6%.
Более Z/Z спонтанных абортов проходит в I триместре беременности, такая патология как трисомия по хромосоме 21 элиминируется во время эмбриогенеза на 70%, трисомии 13 и 18 - на 90-95%, триплоидия - до 100%, моносомия X - до 99%. Суммируя данные по частоте анеуплоидии в ооцитах, сперматозоидах человека и данные по спонтанным абортам, можно определить динамику снижения частоты аномальных эмбрионов в пренатальном периоде: момент оплодотворения (38%), предимплантационный период (29%), I триместр беременности (15%), III триместр беременности (0,6%) (Plachot,1991). Эти данные ясно показывают, что спонтанные аборты являются мощным средством ранней элиминации дефектных зигот.
Поскольку при хромосомных аномалиях ведущими стигмами являются нарушения морфогенеза, а главными участниками морфогенеза являются клетки и клеточные сообщества, то вполне оправдана попытка исследования основных функциональных стигм культивируемых клеток человека с аберрантным набором хромосом, полученных из материала спонтанных и медицинских абортусов.
С помощью культивируемых клеток человека имеется возможность анализа патогенетических механизмов не только на клеточном уровне, но и на молекулярно-биохимическом уровне. Используя культивируемые клетки человека с аномальным карпотипом. мы имеем принципиально новый подход к анализу клеточного феноти-
па. позволяющий сравнивать геномы человека в норме и при хромосомном дисбалансе и экспериментально изучать проблему эмбри-олетальности у человека.
Вся совокупность клинических исследований абортусов и детей с хромосомными синдромами свидетельствуют о том, что нарушения развития, вызванные хромосомным дисбалансом - это прежде всего нарушения морфогенеза. Основными процессами, лежащими в основе морфогенеза, являются такие клеточные процессы как пролиферация, морфогенетические движения клеток и приобретение клетками формы в ходе дифференцировки. Только имея сведения о факторах, влияющих на эти процессы во время эмбриогенеза, можно более реально представить патогенез эмбриолеталь-ности.
Важную роль в эмбриогенезе играют факторы роста и элементы межклеточного матрикса, которые продуцируются клетками уже на ранних этапах эмбриогенеза. Экспериментально доказана регуляторная роль элементов межклеточного матрикса в эмбриогенезе. Известны основные функции экстраклеточного матрикса в эмбриогенезе: 1) регуляция клеточного движения, участие в морфогенезе органов плода, 2) участие в дифференцировке клеток. 3) роль эмбриональных индукторов взаимодействия между тканями эмбриона. Нарушение синтеза элементов межклеточного матрикса может значительно отражаться на фенотипе носителя, так мутационные повреждения синтеза протеогликанов является причиной формирования пороков развития у мышей cmd/crad, bra/bm ( Muir, 1983 ). Полная блокада транскрипции гена коллагена альфа 1(1) приводит к ранней гибели эмбрионов экспериментальных животных (Schnleke et al., 1983 ). В работе с трансгенными мышами, несущими сконструированный "мутантний ген коллагена альфа 1(1), было отмечено, что даже при наличии 10% мутантных цепей коллагена в организме наблюдалось формирование патологического фенотипа ( Stacey et al., 1988 ).
Имеется богатый экспериментальный материал, свидетельствующий, что тератогены, нарушающие синтез элементов межклеточного матрикса, приводят к развитию врожденных пороков развития у человека и животных ( в первую очередь речь идет о таких препаратах как талидомид, салйцилаты, кортикостероиды и т.д.). Если женщина во время беременности принимает противоэпилепти-ческий препарат фенитоин ( нарушающий синтез гликозоаминогли-канов ). то у ребенка могут развиться типичные для хромосомных синдромов черепно-лицевые аномалии ( широкая, плоская переносица, низко посаженные уши, эпикант, гипертелоризм и т.д. ) (Van Lang et al.. 1984 ).
В норме жизнедеятельность клеток находится под контролем
различных регуляторних систем, в частности, -системы циклических нуклеотидов. Циклический аденозин-3'. 5'-монофосфат ( цАМФ ) и циклический гуанозин-3.',5'-монофосфат ( цГМФ ) опосредуют действие на клетку ряда гормонов, факторов воспаления и других биологически активных веществ ( Северин и Кочеткова. 1985; Федоров, 1979 ). Процессы клеточного деления, роста, дифференцировки клеток сопряжены с изменением содержания цАМФ ( Cramer and Schultt. 1977 ).Активность ферментов, обеспечивающих биосинтетический путь, подавляется при повышении уровня цАМФ, а активность ферментов катаболизма повышается ( Северин и Кочеткова, 1985; Ткачук, 1983'). Таким образом, цАМФ участвует в обмене различных белков, в том числе и белков межклеточного матрикса. Показано, что увеличение содержания цАМФ в клетках приводит к снижению продукции коллагена (Baum et al.. 1980 ).
Суммируя имеющиеся данные, . можно констатировать, что такие важнейшие показатели как пролиферативная активность клеток, синтез основных экспортных белков клетки, уровень внутриклеточных посредников могут влиять на морфогенез плода, все эти показатели могут быть исследованы в экспериментах in vitro.
Существует мнение, что одной из причин развития аномального фенотипа плодов и новорожденных детей с трисомным карио-типом может быть не только дисбаланс структурных генов, картированных на дополнительных хромосомах, но и,такой фактор как нарушение в трисомной клетке соотношения структурных и регуля-торных генов. В связи с этим представляет большой интерес изучение в клетках эмбриолеталей человека спектра таких регуля-торных генов как гомеобоксные гены. Достаточно хорошо известно, что гомеобоксные гены являются регуляторами эмбрионального развития ( Tabin, 1991, Malvlllio. 1993 ). Сотрудники Медико-генетического научного центра РАМН Мглинец и Иванов (1976) в экспериментах на Drosophila показали, что мутации гомеобокс-ных генов приводят к различным нарушениям морфогенеза.
Все эти данные свидетельствуют о том, что исследование культивируемых эмбриональных клеток человека с аномальным ка-риотипом может по новому осветить такую проблему как исследование пат генеза эмбриолетальности человека. Изучение патогенетических механизмов развития хромосомных болезней является актуальной проблемой медицинской генетики (Wltkowskl and Schrock,1990) и изучение общих механизмов патофеногенеза хромосомных аномалий может оказаться полезным при исследовании тератогенного эффекта менделирующих генов.-
Актуальность проблемы. Генетически детерминированные нарушения морфогенеза у человека занимают заметное место в наследственной патологии человека. До недавнего времени существо-.вало только два подхода к феногенетическому анализу нарушений морфогенеза У человека - моделирование на животных и патомор-фологическое исследование с ретроспективным обращением к данным эмбриологии. Благодаря применению культивируемых клеток стал возможным экспериментальный подход к феногенетическому анализу нарушений морфогенеза у человека.
. В настоящее время накоплен значительный материал о фенотипе спонтанных абортусов, новорожденных и взрослых индивидов с аномальным набором хромосом, однако эти сведения но дают представления _ о патогенезе этой широко распространенной наследственной патологии. Имеющиеся в настоящее время данные не могут ответить на вопрос о причинах полиморфизма фенотипа носителей хромосомных синдромов, ' когда одна и та же аномалия кариотапа может привести к прекращению внутриутробного развития, может быть обнаружена у новорожденного ребенка с пороками развития или, как в случае болезни Дауна, привести к незначительным изменениям фенотипа, совместимыми с жизнью и даже фер-тильностью.
В настоящее время опубликовано значительное количество работ по изучению эффекта дозы триплицированных генов (Epstein,1986), однако эти данные внесли мало нового в понимание патогенеза хромосомопатии. В последние годы предпринята попытка исследования проблемы эмбриолетальности на клеточном уровне ( Кулиев,1975 ). Понятно, что попытка изучить патогенез хромосомных болезней на клеточном уровне вместе с тем представляет собой попытку 'описать фенотип на клеточном уровне.
Цель и задачи исследования.
Основной целью настоящей работы было изучение клеточных и биохимических параметров эмбриолеталей человека с аберрантным набором хромосом. В экспериментах использованы штаммы фиброб-ластных клеток, выведенных из материала абортусов человека с наиболее часто встречающимися типами аномалий кариотипа ( три-сомия, моносомия, триплоидия ). Были поставлены следующие основные задачи: исследовать синтез основных экспортных белков фибробластных клеток с аномальным кариотипом (белков экстраклеточного матрикса), изучить функционирование белоксинтезирую-щего аппарата этих клеток, исследовать систему вторичных внут-
риклеточных посредников. Для достижения поставленной цели в ходе исследования решались следующие конкретные задачи:
-
Пополнить клеточный банк Медико-генетического научного центра Российской академии медицинских наук панелью штаммов эмбрионального происхождения с диплоидным и аномальным кариотипом.
-
Изучить продолжительность успешного культивирования и показатели пролиферативной активности штаммов с аномальным кариотипом.
3. С помощью коллагеназного теста исследовать синтез кол
лагена - основного белка межклеточного матрикса. изучить такие
его показатели как внутриклеточный распад проколлагена. ' соот
ношение коллагена типа I и типа III. определение степени гид-
роксилирования остатков пролина альфа-цепей коллагена типа I.
-
Исследовать синтез другого важного белка межклеточного матрикса - фибронектина.
-
Исследовать синтез и распад глнкозоаминогликанов в клетках с аберрантным набором хромосом, определить относительную продукцию гепарансульфата. дерматансульфата и хондроитин-сульфата с помощью метода электрофоретического Фракционирования гликозоаминогликанов на ацетатных пленках.
-
Исследовать соотношение мембраносвязанных и свободных полирибосом в клетках с аномальным кариотипом, определить время синтеза средней полипептидной цепи, определить фазность распада белков в клетках человека с аберрантным набором хромосом.
-
Определить концентрацию цАМФ и цГМФ в клетках с аномальным кариотипом.
-
Изучить экспрессию таких'регуляторов эмбриогенеза как гомеобоксные гены.
-
Сформулировать представление о клеточных аспектах реализации хромосомного дисбаланса у человека.
Научная новизна работы.
Одним из итогов выполненной работы явилось значительное пополнение коллекции штаммов человека с аномальным кариотипом и контрольных диплоидных штаммов. Штаммы.получены из материала спонтанных, медицинских абортусов, биопсий кожи пациентов с генными и хромосомными синдромами. Проведен цикл работ, дающих комплексное представление о пролиферативных особенностях диплоидных и анеуплоидных штаммов человека, выведенных из биопсий эмбрионов; получены данные, свидетельствующие о снижении жизнеспособности клеток абортусов с аномальным набором хромосом.
Впервые проведено комплексное исследование основных ком-
понентов межклеточного матрикса серии эмбриональных штаммов с диплоидным и аномальным кариотипом, полученные данные свидетельствуют о наличии измененной структуры межклеточного матрикса в штаммах с аномальным кариотипом, что может быть одной из причин нарушения развития плода.
Впервые в фибробластных клетках абортусов с аномальным кариотипом исследована система внутриклеточных посредников (цАМФ и цГМФ), изменение в этой системе приводит к нарушению каскада реакций, регулирующих активность многих ферментов.
Впервые при исследовании белоксинтезирующого аппарата клеток спонтанных абортусов показано, что наличие в кариотиие дополнительных хромосом нарушает программу координированной работы различных генов.
Показана возможность изменения экспрессии во время эмбриогенеза человека таких регуляторов морфогенетических процессов-как гомеобоксные гены.
Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что в клетках с аномальным кариотипом. полученных из материала спонтанных абортусов, значительно изменено функционирование важнейших клеточных систем и эти изменения носят однотипный характер, что позволяет предположить наличие "канализированного механизма" реализации хромосомного дисбаланса в случае эмбриолеталь-ности. Следует отметить, что результаты большинства проведенных экспериментов на материале абортусов человека были получены впервые в мире, что обеспечивает приоритетность информации о клеточной реализации хромосомного дисбаланса при исследовании проблемы эмбриолетальности у человека.
Научно-практическая ценность работы.
Представлен перечень метаболических нарушений, обнаруженных в клетках эмбриолеталей человека, эти нарушения и также обнаруженные изменения пролиферативного потенциала эмбриональных клеток с аберрантным кариотипом могут быть основой формирования аномального фенотипа плода. Получены данные, развивающие представления о клеточных аспектах реализации хромосомного дисбаланса у человека. Полученные приоритетные данные значительно расширяют наши представления о патогенетических механизмах эмбриолетальности у человека, они могут быть использованы для создания концепции генетически детерминированных клеточных механизмов морфогенеза и его нарушений у человека. Результаты исследования клеток с аномальным набором хромосом позволяют выявить возможные последствия, которые могут 'возникнуть в функционировании диплоидных клеток человека при введе-
нии экзогенных фрагментов ДНК.
Положения, выносимые на защиту.
1-. Культивируемые клетки с аномальным кариотипбм. полученные из плодного материала эмбриолеталей человека, характеризуются снижением жизнеспособности.
-
В культивируемых клетках эмбриолеталей нарушен синтез основных компонентов межклеточного матрнкса: коллагена, фибро-нектина, гликозоаминогликанов.
-
Эмбриональные клетки с аномальным карнотипом имеют значительные нарушения внутриклеточного катаболизма белков, что проявляется в изменении скорости деградации белков, в изменении соотношения быстрообменивающихся и медленнообменнвающихся белков.
-
Трисомные клетки имеют измененный уровень внутриклеточного посредника цАМФ, что может свидетельствовать о нарушении функционирования мембранного комплекса клеток и может приводить к каскаду реакций, нарушающих активность различных ферментов.
-
Показана возможность изменения спектра гомеобоксных генов, регулирующих морфогенез плода, в эмбриогенезе человека.
Внедрение результатов работы.
В результате проведенной работы значительно пополнился клеточный банк Медико-генетического научного центра РАМН. В процессе работы в клеточном банке были заморожены образцы культивируемых фибробластных клеток с диплоидным и аномальным кариотипом, а также клетки от больных с генными мутациями. В. настоящее время в клеточном банке хранится более 800 клеточных'.' штаммов.. Все клеточные штаммы доступны как для отдельных исследователей, так и для научных коллективов, ведущих разработку научных программ. Данные по клеточному банку опубликованы в "Каталоге всесоюзной коллекции клеточных культур" (Ленинград, "Наука", 1991 г.). Наши данные вошли в широко известный учебник по генетике человека (F.Vogel, A.G. Motulsky. Human Genetics. Problems and Approaches. 1979, 1982). На русском языке этот учебник вышел в 1989 г.
По материалам работы .подготовлены и изданы (МЗ СССР, 1990) "Методические рекомендации по культивированию клеток для диагностики наследственных болезней человека", которые внедрены в областных медико-генетических кабинетах Российской Федерации и стран СНГ. а также глава в книгу "Методы культивирования кле-
ток" (Ленинград, "Наука", 1987 г.).
Опубликованные нами данные могут быть использованы для изложения лекционного материала о клеточных аспектах эмбриоле-тальности человека.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на IV, V, VI съездах ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Кишинев, 1982, Москва, 1987, Минск, 1992), на I и II съездах общества медицинских генетиков (Киев, 1984, Алма-Ата. 1990), II и III Всесоюзных совещаниях "Культивирование клеток животных и человека" (Пущине 1985, 1987), V и VI конференциях участников программы "Ген" (Москва, 1982, 1983), XIV международном генетическом конгрессе (Москва, 1978), на Всесоюзных симпозиумах "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1983, 1987), на симпозиуме "Структура и функция лизосом" (Тбилиси, 1986), симпозиуме "Профилактика наследственных болезней" (Вильнюс, 1986), 7 Всесоюзном совещании эмбриологов (Ленинград, 1986). I съезде медицинских генетиков УССР (Львов, 1988). VI Celostany zlazd lekarske genetlky (Banska Bystrica, 1988). Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток (Зеленоград, 1989), 3 National Congress of Medical. Biology and Genetics (Varna, 1990), Всесоюзных конференциях "Геном человека" (Переяславль-Залесский, 1990, 1991), 8 International Congress of Human Genetics (Washington, 1990), 18 Meeting of the European Study Group for Cell Proliferation (Budapest. 1992), 24, 25, 26 Annual Meetings of European Society of Human Genetics (Elsinore, 1992; Barselona, 1993; Paris, 1994). 5 International Congress on Cell Biology (Madrid, 1992), на Ученом Совете ИМГ АМН СССР (Москва, 1987, 1988), на Ученом Совете МГНЦ РАМН ( Москва. 1990, 1991, 1993 ).
Публикации.
По теме диссертации опубликована 51 работа в отечественной и зарубежной печати.