Введение к работе
з
Актуальность темы.
Нарушение механизма точного воспроизведения генетического материала увеличивает частоту мутаций, что у человека выражается в возрастании частоты наследственных болезней и рака. Мутации возникают преимущественно в определенных сайтах генома, предрасположенных к мутированию, которые называют «горячими точками» мутагенеза. В нашей работе мы исследовали многоступенчатые механизмы появления мутаций и природу сайтов с аномально высоким уровнем мутабильяости.
Значительная часть спонтанных мутаций происходит при репликациии ДНК. Известно, что механизм обеспечения высокой точности репликации ДНК у Escherichia coli включает три последовательных этапа: выбор комплементарных матрице нуклеотидов ДНК-полимеразой III, коррекцию ошибок с помощью 3'->5' экзонуклеазнои активности s-субъединицы ДНК-полимеразы III и посгрепликативную репарацию неспаренных оснований. Механизмы контроля точности репликации ДНК эукариот изучены значительно меньше. В частности, неясно, какие ДНК-полимеразы участвуют в репликации основной части генома эукариот; какую роль играют 3'->5' экзонуклеазы, ассоциированные с репликативными ДНК-полимеразами, в контроле точности репликации хромосом; как организована репликация лидирующей и отстающей нитей ДНК. В работе мы разработали оригинальный подход к анализу этих проблем, применяя аналоги оснований в качестве специфического инструмента для выявления ошибок репликации, происходящих при репликации разных нитей ДНК.
Индуцированные мутации происходят при ошибках репарации и репликации, вызываемых нарушениями структуры ДНК. Важной задачей в настоящее время является расшифровка механизмов действия химических мутагенов, которые, как выяснилось, являются постоянно действующим фактором окружающей среды. Мы исследовали механизмы, защищающие ДНК и клетку от химических мутагенов, начиная с поступления/транспорта мутагена в клетку, метаболизма, до реакции с ДНК и действия систем репарации и репликации поврежденной ДНК при становлении мутации. Для этого мы изучили у дрожжей и бактерий действие мутагенов разного типа, создавая и используя специальные системы для анализа генетического контроля и специфичности мутагенеза.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются одним из наиболее удобных для генетических исследований эукариотическим объектом благодаря сравнительной простоте их организации и возможности комплексного использования в работе с ними генетических и молекулярно-биологических подходов. В то же время, сходство организации клеток дрожжей и высших эукариот делает дрожжи уникальной моделью для изучения механизмов, действующих в клетках всех эукариотических организмов. Применение дрожжей позволило исследовать механизмы возникновения мутаций не только у гаплоидных, но и у диплоидных клеток. Теоретические исследования механизмов мутагенеза в работе позволили создать и апробировать систему штаммов дрожжей-индикаторов генетически опасных факторов.
Задачи исследования.
Создание систем для анализа механизмов возникновения мутаций у прокариоти-ческих и эукариотических микроорганизмов. Изучение механизмов становления мутаций при ошибках репликации и репарации, клеточных систем защиты от мутагенов, особенностей мутагенеза в диплоидных эукариотических клетках. Создание штаммов дрожжей для регистрации генетически опасных факторов окружающей среды.
4 Положения, выносимые на защиту.
Возникновение мутаций при действии химических мутагенов у эукариот -многоступенчатый процесс, включающий: поступление в организм, превращения мутагена неспецифической системой метаболизма чужеродных соединений, транспорт/проникновение в клетки-мишени, превращения мутагена специфическими для него системами активации/дезактивации, реакции с основаниями ДНК или включение в ДНК, репарацию модифицированной ДНК и репликацию ДНК, содержащей или бреши, или необычные основания. Вероятность появления новой последовательности ДНК (мутации) зависит не только от типа модификации ДНК, но и от локального контекста ДНК вблизи сайта мутации, типа реплицирующейся нити (лидирующей или отстающей) и от функционаьного состояния аппарата репликации.
Научная новизна.
В работе для анализа механизмов мутагенеза использованы микроорганизмы: прокариоты - бактерии Е. coli и Salmonella typhimurium и эукариоты - дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia methanolica. Применены три основных подхода: а) исследование частоты индуцированных мутаций у мутантов по системам защиты от мутагенов или в системе микроорганизмы-индикаторы/клеточные экстракты печени животных и птиц; б) конструирование штаммов-детекторов мутаций, позволяющих определять тип и механизм возникновения мутаций, индуцированных мутагенами; в) использование еяециатыго подобранных мутагенов, различающихся по механизму действия (так, аналоги оснований вызывают мутации при ошибках репликации, УФ-свет -при ошибках репарации, пропиолактон - при ошибках и репарации, и репликации). В результате впервые:
исследована метаболическая активация 2-аминофлуорена (2-АФ) и инактивация N-метил-Л^-нитро-Л-нитрозогуанидина в тесте дрожжи/микросомы. Показано, что мутагенная активность 6-Лг-гидроксиламинопурина (ГАП) не модифицируется препаратами микросом; микросомы печени курицы обладают более высокой активностью по превращению 2-АФ в мутаген, по сравнению с препаратами печени мышей
установлено, что система эксцизионной репарации дрожжей предотвращает возникновение мутаций при действии метаболитов 2-АФ и 2-ацетил-АФ
получены мутанты haml у дрожжей, сверхчувствительные к мутагенному действию аналога оснований ГАП; показано, что ген НАШ консервирован в эволюции - имеет гомологи у широкого спектра организмов, от кишечной палочки до человека, следовательно, играет важную роль в жизнедеятельности клетки; установлена локализация новых генов, отличающихся от гомолога гена НАМ!, контролирующих мутагенное и летальное действие аналогов оснований у бактерий
показано, что мутагенное действие ГАП у дрожжей модифицируется генетическими блоками путей биосинтеза и реутилизации пуринов (мутации adel, ade2, ade!2, aahl, aprtl). В результате получена возможность искусственно контролировать эффективность мутагенного действия ГАП на дрожжи
установлено, что мутагенное действие аналога оснований ГАП у бактерий и дрожжей не зависит от общих систем репарации: эксцизионной, рекомбинационной, репарации неспаренных оснований; ГАП не является индуктором митотической рекомбинации у дрожжей
показано, что и дТТФ, и дЦТФ включаются в ДНК напротив аналога оснований 6-N-шдроксиламинопурина (ГАП) от vitro Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 при использовании олигонуклеотида-матрицы, содержащего данный аналог основания в определенном положении, причем дТТФ включался более эффективно, чем дЦТФ
продемонстрировано, что аналог оснований 8-оксигуании дезокситрифосфат (8-дОГТФ), присутствующий в ДПК-полимеразной реакции in vitro в эквимолярной природным предшественникам концентрации, провоцирует ошибки ДНК-полимераз, корректируемые 3'->5'экзонуклеазой. Распределение ошибок репликации в присутствии 8-дОГТФ экстрактами культуры тканей человека практически одинаково в лидирующей и отстающей нитях ДНК
изучены спектры мутаций индуцированных ГАП у бактерий и дрожжей методами секвенироваиия; продемонстрировано, что ГАП индуцирует в бактериальном гене lad и в дрожжевом гене URA3 транзиции ГЦ->АТ и AT—»ГЦ; горячими точками транзиций ГЦ-»AT являются последовательности ДНК типа «АГА» и, только у дрожжей, монотонные повторы нуклеотидов; мутации распределены асимметрично по цепям ДНК, что указывает на неодинаковую частоту ошибок репликации в присутствии аналога оснований при синтезе лидирующей и отстающей цепей ДНК
ГАП применен для изучения механизмов контроля точности репликации у эукариот: при изучении ГАП-мутагенеза у штаммов дрожжей с отсутствующей экзонуклеазной активностью ДНК-полимераз є или 8 (мутации ро!2-4 иро13-01) показано, что пары ГАП с нормальными основаниями могут корректироваться при синтезе ДНК in vivo
создана модель для изучения провоцируемых ГАП ошибок репликации при синтезе лидирующей и отстающей нитей ДНК у дрожжей и установлено, что ДНК-полимеразы эпсилон и дельта корректируют ошибки репликации на разных нитях ДНК, а индуцированные ГАП ошибки возникают существенно чаще на той цепи ДНК, коррекция которой осуществляется ДНК-полимеразой эпсилон
ангимутаторные мутации в генах всех трех репликативных полимераз резко снижают мутагенез на более мутабильной нити ДНК; следовательно, оптимальная работа репликативного комплекса необходима для возникновения "горячих точек" репликативного мутагенеза; мутагены, действующие при «ошибках репарации» -этилметапсульфонат и ультрафиолетовый свет, индуцируют мутации в обеих цепях с одинаковой частотой
у диплоидов дрожжей пропиолактон индуцирует мутантов по двухступенчатому механизму «мутирование-рекомбинация», а ГАП - по механизму «возникновение мутаций в обеих копиях гена» с частотой, лишь на порядок меньшей, чем у гаплоидов.
Теоретическая и практическая ценность работы.
Полученные в нашей работе данные о механизмах, защищающих клетки от мутагенов, использованы для а) направленного получения организмов, устойчивых/чувствительных к мутагенам б) создания тестеров для оценки мутагенной активности факторов окружающей среды. Активация промутагенов препаратами печени курицы может быть эффективной альтернативой применению дорогостоящих препаратов печени крыс. Полученные данные могут быть использованы при прогнозировании генетических последствий действия мутагенов типа аналогов оснований. Данные об участии ДНК-полимераз S и є в коррекции ошибок при репликации разных нитей ДНК необходимо учитывать при создании моделей организации аппарата репликации ДНК и при изучении механизмов контроля точности репликации ДНК у эукариот. Данные о молекулярной специфичности действия ГАП открывают возможность использования этого мутагена для получения специфических мутаций в определенных последовательностях ДНК. Исследования механизмов мутирования диплоидных клеток дрожжей являются основой для понимания процессов мутагенеза и, возможно, канцерогенеза, в соматических клетках.
Набор интегративных плазмид с мутантними аллелями гена URA3, полученный в нашей работе, используется в лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ для
конструирования миссенс- и нонсенс-мутаций в штаммах дрожжей любого генотипа. Система анализа мутаций по гену LYS2 применяется для изучения мутагенов и механизмов трансляционной супрессии в этой же лаборатории. Созданные нами штаммы-тестеры широко применяются в СНГ при проведении работ по экологической генетике (Институте микробиологии академии наук Молдовы, Кольском филиале РАН, кафедре микробиологии СПбГУ, Санкт-Петербургском институте усовершенствования врачей, Санкт-Петербургском медицинском университете им акад. И.П. Павлова, Пермском Медицинском институте и других).
Место проведения работы.
Основная часть работы выполнена в лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ и на кафедре генетики и селекции СПбГУ. Часть экспериментов проведены в лабораториях молекулярной генетики NIEHS, США и молекулярной биологии Осакского университета, Япония. Экспериментальный материал получен непосредственно автором или студентами, аспирантами и соискателями под его руководством. Так, в работе принимали участие Ланге Е.К., Горбачева О.В., Носков В.Н., Куликов В.Н., Тарутина М.Г., Сарсенова С.Ж., Тюлякова Т.С., Чекуолене Ю.В., Трофимова М.В., МоисееваЕ.В., ТарунинаО. В., Щербакова П.В., Суслов В.В., Штаак К., Тирлих М., Пшеничнов М. Р., Тран Туан Хиеп, Козьмин С.Г. Часть результатов получена в соавторстве с Н.Н.Хромовым-Борисовым, С.Г. Инге-Вечтомовьгм, Д.А. Гордениным, Ю.О. Черновым, К. Саснаускасом, И.И. Толсторуковым, Т.А.Карповой, Г.И. Сизоненко, Т.А. Бехтеревой, Т.А. Канкель, Д. Минник, P.M. Шаапер, К. Негиши, X. Хайацу, А. Сугино, Б-С. Оно, А. Матсуда, В.Д. Домкиным, A.M. Зехновым, И.Б. Рогозиным, В.В. Аленшшм, М.Г. Гецовой, Е.П. Гуськовым, М.Д. Тер-Аванесяном, Л.А. Алексеевич, Д. Читавичюсом, Г.А. Евдокимовой, А.Г. Мухленовым, М.Г. Самсоновой, Ю. Просцявичусом.
Апробация работы.
По результатам работы сделаны сообщения на конференциях : Всесоюзных симпозиумах «Молекулярные механизмы генетических процессов», 1979, 1987 и 1990; Всесоюзных съездах ВОГиС, 1983,1987; 14-th Annual Meeting of the European Environmental Society, 1984; на заседаниях секции генетических аспектов проблемы «Человек и Биосфера» при ГКНТ (1979-1989); на симпозиуме «Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций", Вильнюс, 1986; 6-th International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms GIM90, Strasbourg France, August 1990; Gordon Research conference (Mutagenesis), 1992; Environmental Mutagen Society Annual Meeting, Norfolk, Virginia, April, 1993; Gordon Research Conference (Genetic Toxicology), New Hampshire, USA, July 1993; Gordon Research Conference (Mutagenesis), New Hampshire, USA, June 1994; Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Washington, Seattle, USA, August 1994; 1-м съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров в Саратове в декабре 1994; Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Wisconsin, Madison, USA, August, 1996; 5-th International Conference on Mechanisms of Antimutagenesis and Anti carcinogenesis, Okayama University, Japan, December 1996; Conference "Mechanisms of DNA Repair and Mutagenesis" the 100-th Anniversary of the Discovery of Polonium and Radium, Warsaw, October 1997; на семинарах кафедры генетики и селекции СПбГУ и лаборатории физиологической генетики БнНИИ СПбГУ.
7 Структура и объем диссертации.
Актуальность темы 3
Задачи исследования 3
Положения, выносимые нл защиту 4
Научная новизна 4
Теоретическая и практическая ценность работы 5
Место проведения работы 6
Апробация работы 6
Структура и объем диссертации 7