Введение к работе
Актуальность теш диссертации.
Производство аминокислот - одна из перспективных отраслей микробиологической промышленности. Микробиологический способ производства аминокислот дает возможность получения биологически активных L-изомеров на основе дешевого и доступного сырья. Фенил-алашш относится к незаменимым аминокислотам и используется во многих областях промышленности и медицины, в частности, для получения дипептидного заменителя сахара - аспартама.
В настоящее время большая часть аминокислот, получаемых мик-робологическим способом, производится с помощью мутантних штаммов глутаматпродуцирующих коринебактерий (Corynebacterium glutamlcum, Brevlbacterlum llavum и Brevibacterlum lactofermentum). Методы генной инженерии, которые' с успехом используются при создании высокоэффективных продуцентов на основе таких микроорганизмов, как кишечная и сенная палочки (E.coll и Bac.subtllls), пока не нашли должного применения для выведения продуцентов аминокислот на основе коринебактерий. В частности, до.сих пор нет ни одного коринебактериального продуцента аминокислот, созданного с использованием методов генной инженерии, который нашел бы применение в промышленности.
Развитие систем клонирования для глутаматпродуцирующих коринебактерий и изучение экспрессии генов в клетках коринебактерий позволит ускорить процесс создания новых и улучшению уже имеющихся штаммов-продуцентов аминокислот. Амплификация в клетках коринебактерий генов, кодирующих ферменты лимитирующих этапов биосинтеза аминокислот, может приводить к усилению метаболитического потока в направлении необходимого продукта и'является путем к созданию эффективных продуцентов аминокислот. Отсюда вытекает необходимость клонирования и изучения коринебакгериальных генов, детерминирующих ключевые ферменты аминокислотных биосинтетических путей, а также дальнейшее развитие системы молекулярного клонирования для коринебактерий.
Цель работы.
Целью настоящей работы было клонирование двух генов ароматического биосинтеза из аналогорезистентного продуцента фенилалани-на Corynebacterium glutamlcum, которые кодируют ключевые ферменты биосинтеза фенилаланина - З-дезокси-й-арабиногептулозонат-7--фосфат-синтетазу (ДАШ-синтегаза, КФ 4.1.2.15) и префенатдегидра-
тазу (ПД, КФ 4.2.1.51), для их дальнейшего использования при конструировании продуцентов фенилаланина.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие экспериментальные задачи: получение рекомбинантных штаммов Cor.gluta-micum с повышенной экспрессией гена pheA, кодирующего ПД; определение нуклеотидной последовательности мутантного гена pheA; локализация и характеристика мутации в клонированном гене pheA; клонирование гена, кодирующего ДАГФ-синтетазу, используя метод ЩР; изучение экспрессии клонированого гена в клетках E.coli и корине-Сактерий, а также возможности использования его для конструирования продуцентов ароматических аминокислот; получение челночного вектора для бактериальной,системы E.coli коринебактерии, совместимого с уже имеющимися; определение стабильности полученного вектора в клетках коринебактерии и рекомбинантных ДНК на его основе .
Научная новизна работы.
В работе сконструировано семейство векторов для клонирования ДНК в промышленно-важных коринебактериях, совместимое с имеющимися и обладающее рядом преимуществ по сравнению с полученными ранее. Клонирован мутантний ген pheA, определена его нуклеотидная последовательность-, локализована и охарактеризована мутация, приводящая к устойчивости префенатдегидратазы к ретроингибированию. Клонирован ген из аналогорезистентного мутанта Cor.glutamicum, кодирующий ДАГФ-синтетазу. Показано увеличение активности ДАГФ-синтетазы в клетках E.coli и Cor.glutamicum, содержащих плазмиды с клонированным геном. Совокупность генетических и биохимических данных позволяет утверждать, что в клетках Cor.glutamicum существуют по крайней мере две изоферментные формы ДАГФ-синтетаз'. Ген ого А, кодирующий одну из них, клонирован в настоящей работе.
Практическая ценность работы.
Осуществленное в данной работе клонирование ключевого гена биосинтеза фенилаланина C.glutamicum на многокопийных векторах, результаты по изучению нуклеотидной последовательности и характеристике мутации гена pheA могут быть использованы при конструировании генно-инженерных продуцентов фенилаланина. Амплификация гена, кодирующего ДАГФ-синтетазу, может использоваться при получении продуцентов других ароматических аминокислот. Высказанное заключение о существовании двух изоферментных форм ДАГФ-синтетаз
у Cor.glutamlcum открывает новые возможности в конструировании продуцентов ароматических аминокислот. Полученные векторы могут быть использованы при клонировании других генов в этом промышлен-но-важном объекте.
Структура и объем диссертации.