Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Клонирование и молекулярный анализ генов в клетках цианобактерий Еланская, Ирина Владимировна

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Еланская, Ирина Владимировна. Клонирование и молекулярный анализ генов в клетках цианобактерий : автореферат дис. ... доктора биологических наук : 03.00.15.- Москва, 1994.- 50 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность проблемы. Цианобактерии являются перспективными модельными объектам для изучения различных биологических процессов. По структуре клеточной оболочки и организации генома цианобактерии относятся к грамотрицателъным бактериям, тогда как строение фотосинтетического аппарата и способность к оксигенному фотосинтезу приближают их к высшим растениям. Швнобактерик являются, в перспективе, наиболее выгодными для биотехнологии продуцентами белка и ценных биологически активных соединений, поскольку не требуют органических источников питания и синтезируют все необходимые для жизнедеятельности вещества за счет фотосинтеза. Цианобактерии широко используются в исследованиях механизмов и генетического контроля азогфиксаыии, клеточной дифференцировки, радиоустойчивости, а также проблем, связанных с регуляцией действия генов, однако особый интерес к цианобактериям связан с изучением фотосинтеза. У растений и зукариотических водорослей генетическое изучение фотосинтеза затруднено из-за отсутствия эффективных систем генетического переноса, а также из-за сложных взаимодействий между хлоропластным и ядерным геномом в процессе формирования фэгосинтетического аппарата. Разработка простой модельной системы, позволяющей изучать фотосинтез и ряд связанных с ним процессов (например, развитие устойчивости к гербицидам - ингибиторам фотосинтеза) на прокариотических объектах, могла бы значительно повысить эффективность генетических исследований в этой области.

Возможности использования цианобактерии для расшифровки механизмов фундаментальных биологических процессов и создания шташов-продуцвнтов могут быть значительно расширены за счет методов генетической инженерии. К началу наших исследований (1980 г.) были разработаны методы генетической трансформации некоторых штаммов одноклеточных цианобактерии (SnestaKov, . Khuyen, 1970; Grlgorleva, Shestakov, 1976,1982) и обнаружены критические плазмиды цианобактерии (Van den Hcndel et al., 1979; Lau, Doolittle 1979; Frledberg. Seitffers. 1979). Эти работа открывали возможности для создания систем клонирования генов в-клетках цианобактерии и позволили нам приступить к разработке векторных систем для двух видов одноклеточных

цианобактерий: облигатно фотоавтотрофной цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 (Anacystls nidulans R2) и фзтогетеротрофной цианобактерий Synechocystls sp. РСС 6803.

Цель х задачи исследования. Целью работы было создание систем клонирования генов для цианобактерий A. nidulans R2 и Synechocystls эр. 6803 и использование этих систем для изучения генетического контроля фотосинтеза, устойчивости к гербицидам и экспрессии гетерологичных генов в клетках цианобактерий. В работе были поставлены следующие задачи:

  1. Конструирование различных типов векторных плазмид для- А. nidulans R2 и Synechocystls sp. 6803 и анализ возможностей их использования для клонирования генов в клетках цианобактерий.

  2. Клонирование гетерологичных генов (включая гены грамгологи-тельных бактерий я растений) в клетках цианобактерий и изучение их экспрессии.

  3. Клонирование и молекулярный анализ генов, контролирупцих фотосинтез, с помощью коллекции дефектных по фотосинтезу мутантов цианобактерий;. идентификация мутаций, нарушающих способность клеток цианобактерий к фотосинтезу.

  4. Клонирование и молекулярный анализ генов, определяющих устойчивость к нитрофэнольннм гербицидам и ингибитору фотосинтеза метронвдазолу; выяснение механизмов развития устойчивости к указанным ингибиторам.

  5. Построение физической карты генома Synechocystls sp. 6803 и локализация на ней генов, контролирующих фотосинтез. ,

Научная новизна. Разработано новое направление генетики одноклеточных цианобактерий, связанное с использованием методологии генетической инженерии. Созданные в работе системы клонирования и анализа генов позволяют использозать циЕНобактерии как модельный объект для генетического изучения фотосинтеза, механизмов развития устойчивости к гербицидам и других фундаментальных биологических процессов, свойственных высшим растениям.

Впервые в клетках цианобактерий . клонированы гена а-амилазы из Bacillus amyloliqueraclens, эндоглшзиазы из целлюлолитнческого комплекса Clostridium thermocellum и В1 -гордеина из ячменя (Hordeum vulgare L.). и показана их экспрессия

Показано, что белки СР47, СР43 и цитохром Ь55Э, кодируемые генами рзЬВ, psbC и рзЬЕ/Г игравт важную роль в определении структуры и функции фотосистемы II. Установлена молекулярная природа ряда мутаций в генах psbB, psbC, рзЬЕ/Г, нарушающих функций фотосистемы II. Выявлен неизвестный ранее ген рзХ, кодирущий белок с молекулярной массой 46,7 кДа и необходимый для функционирования фотосистемы II. Показано, что ген psX имеет гомологии с ядерной ДНК растений.

Клонирован неизвестный ранее ген drgA, контролирухпий множественную устойчивость клеток Synechocystis sp. 68Q3 к метронкдазолу и нитрофенольным гербицидам. Устойчивость клеток цианобактерии к указанным ингибиторам связана с инактивацией продукта гена drgA - белка с молекулярной кассой 23,7 кДа. Ген drgA имеет гомологию с ядерной ДНК растений.

Впервые построена физическая карта и установлен размер хромосомы Synechocystis sp. 6803. На физической карте локализовано несколько генов, кодирующих белки фотосистемы II и фотосистемы I.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе новые данные о генетическом контроле фотосинтеза и устойчивости к ингибиторам способствуют более глубокому пониманию механизмов фотосинтеза и структурно-функциональной организации фотосинтетичвского аппарата, вносят существенный вклад в изучение проблемы развития устойчивости к гербицидам. Сконструированные в работе векторные плазмиды для A. nidulans R2 и Synechocystis sp. 6803, коллекции дефектных по фотосинтезу и устойчивых к ингибиторам мутантов переданы в ряд отечественных и зарубежных лабораторий, где ови используются в научно-исследовательских работах.

Полученные в настоящей работе рекомОинантные штаммы цианобактерии, несущие гетерологичные гены а-ачилазы, эндоглюканазы и В1 -гордеина могут служить хорошей основой для создания экономически выгодных штаммзв-продуцентов запасных белков и биологически актирных соединений.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуддены на V и VI Всесоюзном симпозиуме Молекулярные механизма генетических процессов (Москва, 1983, 1987 гг.), Всесоюзной конфзрєнцки Тене'Лілз и физиология микроорганизмов

-перспективных объектов биотехнологии (Пущино, 1984), IX и X Всесоюзном совещании по программе "Плазмида" (Москва, 1984, 1985 гг.), VII Съезда Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985 г.), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984, 1986), XIV Мевдународном микробиологическом конгрессе (Манчестер, Англия, 1986), Всесоюзной конференции "Физико-химическая биология и биотехнология фото-трофных микроорганизмов (Москва, 1987), 7 Съезде ВОГИС им. Н. И. Вавилова (Москва, 1987), Ломоносовских чтениях МГУ (1989 г.), Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино, 1991 г.), V, VI и VII Международном симпозиуме по фототрофныы прокариотам (Гриндельвальд, Швейцария, 1985 г.; Нордвикерхаут, Нидерланды, 1988 г.; Амерст, CffiA, 1991 г.), Российско-германском рабочем совещании по молекулярной биологии и биотехнологии растений (Москва, 1992 г.), II Российском симпозиуме "Ноше метода биотехнологии растений" (Пущино, 1

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, раздела "Материалы и метода", пяти глав экспериментальной части, заключения, основных выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 237 стр. машинописного текста, включают 58 рисунков и 29 таблиц. В списке литературы приведены ссылки на 285 работ.