Введение к работе
Актуальность темы. Исследование структурной и функциональной организации катаболических систем плазмид биодеградации бактерий рода Pseudomonas представляет несомненный интерес, как в плане изучения процессов эволюции генетических систем биодеградации, так и с точки зрения конструирования новых метаболических путей.
В последние годы все большее -подтверждение находит факт транс-позонподобной организации катаболических систем данных плазмид и их отдельных структурно-функциональных, блоков С Воронин А., ЦоЯ Т 198Э ). Показано, что катаболические гены T0L плаэмиды pVW3, контролирующей деградацию толуола и ксилолов, организованы в виде сложного комплекса транспозонных структур ( Tsuda М. ,Iino Т., 1989 ). Однако механизмы и степень специфичности транспозиции xyl генов в гетерологичньге репликоны изучены недостаточно.
Дальнейшего изучения требует также вопрос о возможности функциональной экспрессии катаболических генов плазмид биодеградации в бактериях, таксонсмически далеких от Pseudononas. В качестве объекта в этом плане несомненный интерес представляют азотфиксиру-ющие бактерии. Бактерии рода Azotobacter, как свободно живущие азотфиксаторы, могут служить модельной системой для изучения возможностей совмещения в клетке энергоемкого процесса азотфиксации и катаболизма ароматических соединений. Представители этой таксономической группы обладают отдельными сходными с Pseudomonas путями катаболизма простых ароматических соединений.
Поскольку, для T0L плазмиды pWWO, избранной в качестве модельной в данной работе, существует различие между репликативным и функциональным кругом хозяев, для введения xyl генов в клетки азотобактера необходимо использование векторной плаэмиды, содержащей катаболические гены в составе репликона плазмиды с широким кругом бактериальных хозяев.
Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы явилось конструирование гибридных плазмид Р.РІ:: T0L и изучение экспрессии xyl генов в бактериях ^ода Azotobacter. В соответствии с основной целью были поставлены следующие конкретные задачи-
1. Методом рекомбинации in vivo получить коллекцию гибридных плазмид Р.Р4:: T0L.
-
Физически и генетически охарактеризовать полученные плазмиды, изучить характер наследования и стабильность в новом генетическом окружении.
-
Изучить механизмы экспрессии xyl генов плазмиды pWWO в составе гибридных репликонов в Azotobacter chroococcura.
Научная новизна и практическая ценность результатов, В ходе выполнения исследований получена уникальная коллекция гибридных плазмид RP4::T0L С pANP ). образованных в результате транспозиции Тп4651, несущего катаболические гены рШО, на репликон RP4. Наличие 17 сайтов интеграции Тп4651 и равномерное их распределение на репликоне Р.Р4 свидетельствуют о низкой специфичности данного китаболического транспозона. Ряд плазмид с нарушенной в результате инсерции Тп4651 стабильностью наследования представляют интерес в качестве исходного материала при создании векторных систем для транспозиции катаболических генов.
При изучении стабильности гибридных плазмид наряду с плазки-дами Р.Р4: :Тп4652, образованными в результате выщепления фрагмента T0L ДНК, содержащего оба xyl оперона, обнаружена гибридная плазмлда, содержащая указанный фрагмент, тандемно дуплицирован-ный в составе Тп4651.
С использованием плазмид pANP показана принципиальная возможность экспрессии катаболических генов T0L плазмиды в клетках азогфиксйрусщих бактерий A. chroococcura. Установлено, что уровень экспрессии xyl генов, достаточный для энергообеспечения функционирования нитрогеназного комплекса, достигается в штаммах A.chro-ococcum, обладающих собственной системой катаболизма катехола.
Показана также широкая субстратная специфичность фермента первичной атаки пути деградации бензоата у A. chroococcum.
Результаты проведенных исследований могут быть использованы для конструирования штаммов азотфиксирующих бактерий, способных к деградации и трансформации неприродных ароматических субстратов.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на X, XI рабочих совещаниях по программе "Плаз-иида" С Пущино, 1983, 1986 ); УІ Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" С Москва, 1987 ); У съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров С Москва, 1387); I Республиканском рабочем совещании по генетической «і клеточной инженерии и биотехнологии растений С Минск, 1990 ); УІ съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров С Горки, 1992 ).
Публикации, основное содержание диссертации отражено в 8 печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения. трех глав - "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований и их обсуждение" - заключения, выводов и списка литературы, вкяачаюаего 154 библиографических названия. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц, иллюстрирована 23 рисунками.