Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Конструирование штаммов-реципиентов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и анализ в их клетках митотической стабильности рекомбинантных плазмид и уровня экспрессии гетерологичных генов Воропаева, Лилия Андреевна

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Воропаева, Лилия Андреевна. Конструирование штаммов-реципиентов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и анализ в их клетках митотической стабильности рекомбинантных плазмид и уровня экспрессии гетерологичных генов : автореферат дис. ... кандидата биологических наук : 03.00.15.- Санкт-Петербург, 1992.- 25 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность исследований. Клетки дрожжей Saccharomy-ces cerevisiae являются традиционными объектами различных исследований в области биотехнологии. Дрожжи—низшие эука-риоты—как продуценты имеют особое преимущество перед прокариотами, т.к. наличие в их клетках корректной системы транспорта, секреции и процессинга делает их универсальной системой накопления эукариотических и вирусных белков.

Конкретные показатели продукци гетерологических белков в любом продуценте определяются кооперативными взаимодействиями в системе «клетка-вектор». Это предполагает проведение генетикоселекционной работы в двух направлениях при осуществлении синтеза: совершенствование структуры экспрес-сирующего вектора и селекция клонов реципиентного штамма, которая необходима на всех этапах констру^ирования — от эффективной трансформации рекомбинантными молекулами ДНК до высокой стабильности сохранения в клетке целевого продукта

Хорошая генетическая изученность дрожжей, наличие разнообразных коллекций штаммов и возможность целенаправленного конструирования их генотипов во многом определило успех использования дрожжевых клеток в генно-инженерной биотехнологии. В связи с ее дальнейшим развитием сохраняет свою актуальность применение традиционных и создание новых подходов в конструировании и селекции реципиентных штаммов дрожжей с оптимальным генотипом для осуществления синтеза конкретного гетерологического белка.

В нашей работе эффективность различных приемов отбора и конструирования реципиентных штаммов для гетерологического синтеза оценивали по уровню продукции двух белков /3-лактамазы E.coli и HBsAg вируса гепатита В. Важным параметром анализируемых штаммов служила также митотическая ста-бильность&Ъмбинантных плазмид в популяции клеток.

Создание продуцентов белка HBsAg, антитела к которому создают основу протективного иммунитета против вируса гепатита В, имеет огромное значение в связи с широким распространением вируса и тяжестью клинических форм заболевания.

Существуют различные приемы накопления HBsAg белка, и дрожжи оказались наиболее эффективными и дешевыми его продуцентами. В настоящее время многие зарубежные фирмы наладили серийный выпуск вакцины на основе дрожжевого рекомбинантного HBsAg (Гендон, 1988). В СССР также получены дрожжевые штаммы и векторы для синтеза HBsAg (Арман и др., Грановский и др., 1986), а также охарактеризованы основные этапы его накопления и очистки (Симоненков и др., 1985; Успенский и др., 1990). Это послужило основой дл ясоздания технологической инструкции по синтезу в дрожжах HBsAg при крупномасштабном культивировании, на основе которой получены первые экспериментально-производственные серии дрожжевой реком-бинантной вакцины на предприятиях Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток. Актуальным является разработка приемов оптимизации производства вакцины, в том числе и за счет создания новых штаммов-реципиентов дрожжей.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в поиске и изучении генотипических детерминант дрожжей, определяющих митотическую стабилизацию гибридных плаз-мид и высокий уровень экспрессии генов jS-лактамазы E.coli и HBsAg вируса гепатита В, для чего предполагали решить следующие задачи:

  1. Конструирование экспрессирующих векторов-эписом-ного и центромерного — для анализа уровня синтеза HBsAg и )3-лактамазы в различных штаммах.

  2. Отбор и генетический анализ мутантов дрожжей с повышенной экспрессией ллазмидного гена-репортера 1?1а и определение в их клетках стабильности векторов и уровня экспрессии гена HBsAg.

  1. Изучение влияния увеличения плоидности клеток на стабильность гибридных плазмид и уровень синтеза гетерологи-ческих белков HBsAg и /2-лактамазы в штаммах как гибридного, так и изогенного происхождения.

  2. Исследование возможного влияния локуса МАТ на митотическую стабильность плазмид с различными типами репликаторов.

  3. Характеристика полученных штаммов в производстве HBsAg при крупномасштабном культивировании.

Научная новизна.

  1. Впервые выявлена большая гетерогенность по активности плазмидного гена-репортера/?-лактамазы E.coli и митотичес-кой стабильности эписомных плазмид в популяции плазмидо-содержащих клонов после длительного неселективного культивирования трансформантов.

  2. Впервые для отбора клонов с повышенным уровнем экспрессии гена HBsAgCBbicoKoft эффективностью использовали предварительный скрининг клеток по уровню экспрессии другого гетерологичного плазмидного гена-репортера /3-лактамазы.

  3. Впервые изучен уровень экспресии гетерологичных генов HBsAg и yS-лактамазы в большой коллекции полилоидных клеток как гибридного, так и изогенного происхождения.

  4. Впервые выявлены случаи как повышенигтак и снижения экспрессии генов HBsAg и/3-лактамазы и стабильности эписомных векторов при увеличении плоидности реципиентных клеток.

Практическая ценность работы. Получена коллекция реципиентных штаммов дрожжей, в клетках которых происходит оптимизация синтеза гетерологичных белков /3-лактамазы и HBsAg. Максимальная продуктивность по HBsAg белку выявлена для штамма Д4015, на основе которого получены 11 экспериментально-производственных серий дрожжевой рекомбинантной вакцины против гепатита В на предприятии Института вакцин и сывороток г. Санкт-Петербурга. Штамм Д4015 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Обнаружена гетерогенность популяции плазмидо-содер-жащих клонов дрожжевых трансформантов после длительного неселективного культивирования по признакам экспресии плазмидного гена-репортера /3-лактамазы и митотической стабильности эписомных плазмид.

  2. Предварительный скрининг клеток по уровню экспрессии гетерологичного плазмидного гена-репортера Ыа служит эффективным способом селекции клонов с повышенным синтезом вирусного белка HBsAg.

  3. В большинстве диплоидных и триплоидных штаммов

наблюдается увеличение синтеза гетерологичных белков /5-лак-тамазы и HBsAg, а также повышение митотической стабильности эписомных плазмид.

4. Структура локуса МАТ штамма-реципиента влияет на митотическую стабильность эписомных плазмид.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференциях молодых ученых во ВНИИ гриппа Минздрава СССР (1989 г.) и Ленинградского института вакцин и сывороток (1988 г.), на Всесоюзной научной конференции во ВНИИТИАФ (1988 г.), на заседании вирусологической секции Общества микробиологов и эпидемиологов (1991 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 182 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов. Текст иллюстрирован 19 таблицами, 12 рисунками. Список литературы включает 204 названия работ отечественных и зарубежных авторов.