Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Организация хроматина и регуляция транскрипции у дрозофилы (обзор литературы) .9
1.1 Структура интерфазного хроматина, ремоделинг и транскрипция 9
1.1.1 АТФ-зависимая мобилизация нуклеосом 9
1.1.2 "Язык" ковалентних гистоновых модификаций 12
1.1.3 ДНК-связывающие транскрипционные факторы и коактиваторы транскрипции 14
1.1.4 Политенная хромосома как модель интерфазной 16
1.2 Дозовая компенсация - уникальный пример хромосомоспецифичной регуляции транскрипции... 18
1.2.1 Феномен дозовой компенсации 18
1.2.2 Гены дозовой компенсации у дрозофилы 19
1.2.3 Комплекс дозовой компенсации 20
1.2.4 Предполагаемые механизмы действия комплекса дозовой компенсации 24
1.2.5 Почему X? -. 26
1.2.6 Сборка и распространение комплекса дозовой компенсации по Х-хромосоме 29
1.2.7 Эволюция MSL - комплекса 32
1.3 Broad Complex - ключевой транскрипционный фактор метаморфоза дрозофилы 34
1.3.1 Вг-С - ключевой ген метаморфоза дрозофилы 34
1.3.2 Молекулярная организация локуса. Белки BR-C 35
1.3.3 Вг-С и регуляция метаморфоза. Предполагаемые механизмы 37
1.3.3.1 Экспрессия гена 37
1.3.3.2 Корреляция между генетическими функциями гена и белковыми изоформами BR-C 38
1.3.3.3 Вг-С и транскрипция регулируемых генов 39
1.3.3.4 Роль продуктов гена. Вг-С в некоторых процессах метаморфоза 42
Заключение и задачи исследования .-44
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1 Линии Drosophila melcmogaster и их ведение 46
2.2 In situ гибридизация 48
2.2.1 Приготовление ДНК зондов 48
2.2.2 Приготовление препаратов для гибридизации in situ 48
2.2.3 Гибридизация in situ в политенных хромосомах 48
2.3 Иммуноокрашивание политенных хромосом 48
2.3.1 Приготовление препаратов 48
2.3.2 Иммуноокрашивание политенных хромосом 49
2.3.3 Анализ препаратов 50
3.2.1 Антитела, использованные в работе 50
Глава 3. Особенности локализации комплекса белков MSL в политенных хромосомах Drosophila melanogaster ..51
3.1 Особенности локализации комплекса на Х-хромосоме 51
3.1.1 Локализация комплекса дозовой компенсации на Х-хромосоме самцов 51
3.1.2 Локализация MSL1 и MSL2 белков в линиях, мутантных по некоторым msl-генам 54
3.1.3 Связывание белков дозовой компенсации с Х-хромосомой в условиях дефицита в ядре полного функционального комплекса 58
3.2 Особенности локализации комплекса на аутосомах 66
3.2.1 Аутосомные сайты у самцов линии Oregon-R 66
3.2.2 Аутосомные сайты в линиях с нехваткой/избытком комплекса в ядре 68
3.2.3 Распространение комплекса по аутосомам от места встройки трансгена roXl в условиях избытка в ядре коровых белков дозовой компенсации 70
3.2.4 Аутосомные сайты повышенной аффинности к комплексу 73
3.2.5 Локализация MSL1 и MSL2 белков в районе аутосомных трансгенов msl2 73
3.3 Влияние теплового шока на локализацию комплекса на хромосомах 74
3.3.1 Локализация комплекса на Х-хромосоме под воздействием теплового шока 74
3.3.2 Множественное аутосомное связывание комплекса в условиях теплового шока 76
3.4 Комплекс дозовой компенсации и его роль в процессе транскрипции 79
3.4.1 Локализация на хромосомах антител, специфически выявляющих форму гистона H4AcLysl6..80
3.4.2 Локализация JIL1 на политенной Х-хромосоме самок и самцов дрозофилы 83
3.4.3 Локализация ISWI на Х-хромосоме самцов и самок дрозофилы 83
3.5 Локализация в политенных хромосомах белка MLE 85
3.5.1 Распределение MLE в политенных хромосомах самцов и самок дрозофилы в лабораторной линии дикого типа Oregon-R 86
3.5.2 . Зависимость аутосомной локализации MLE от других белков комплекса 86
3.5.3 Локализация белка MLE в условиях теплового шока 90
3.6 Обсуждение 92
3.6.1 Связывание и распространение комплекса по Х-хромосоме: иерархия сайтов по их специфичности к комплексу. Верификация существующей модели сборки и распространения комплекса по хромосоме 92
3.6.2 Анализ случаев взаимодействия комплекса с аутосомами как один из подходов к пониманию механизмов его взаимодействия с хроматином. Факторы, нарушающие Х-специфичную локализацию комплекса 95
3.6.3 Локализация комплекса ДК в политенной хромосоме и его роль в процессах транскрипции 99
3.6.4 Функции геликазы MLE 104
Глава 4 . Особенности локализации на хромосомах белков Broad-Complex 107
4.1 Локализация белков BR-C в политенных хромосомах слюнных желёз личинок в лабораторной линии дикого типа Oregon-R 108
4.2 Локализация в политенных хромосомах слюнных желез личинок 3-го возраста антител, специфично узнающих изоформы Zl, Z2, Z3 HZ4 115
4.3 Локализация белков BR-C в политенных хромосомах предкуколки 125
4.4 Роль белков Broad-Complex в регуляции экдизонового каскада генов в слюнной железе дрозофилы (обсуждение) 127
Выводы 130
Список цитированной литературы 132
- Комплекс дозовой компенсации
- Приготовление ДНК зондов
- Связывание белков дозовой компенсации с Х-хромосомой в условиях дефицита в ядре полного функционального комплекса
- . Зависимость аутосомной локализации MLE от других белков комплекса
Введение к работе
Транскрипция ДНК - сложнейший процесс, осуществляемый в интерфазном ядре. В настоящее время у эукариот выявлено и биохимически охарактеризовано большое количество полипептидов, непосредственно связанных с работой РНК-полимеразного комплекса. Однако in vivo ситуация более сложная, так как должна решаться проблема корректного взаимодействия РНК-полимеразы с ДНК-матрицей, организованной у эукариот в виде сложной хроматиновой структуры. Решение данной проблемы, по-видимому, заключено в функциях специфических белковых факторов, взаимодействующих с определенными последовательностями ДНК в промоторных областях генов и/или ремоделирующих и модифицирующих хроматин локально и на протяжении значительных участков. Предполагается, что суммарное действие этих факторов в ядре обеспечивает время- и местоспецифичность процесса транскрипции.
К сожалению, наши знания о механизмах действия этой обширной группы белков и их взаимодействиях друг с другом и РНК-полимеразной машиной остаются неполными, несмотря на наблюдаемый в последние годы прорыв в данной области исследований.
Дрозофила является одним из наиболее удобных модельных объектов для изучения транскрипционного процесса у эукариот. Это обусловлено, с одной стороны, достаточно обширной базой накопленных данных, касающихся организации генома, с другой -неплохой изученностью функций и взаимодействий многих генов и их роли в таких сложных биологических процессах, как эмбриогенез, метаморфоз, определение пола, ответ на стресс и т.д. Кроме того, дрозофила, как и другие представители отряда двукрылых, характеризуется наличием в ряде личиночных тканей уникальных многонитчатых интерфазных хромосом, цитологические работы с которыми позволяют in situ локализовать на хромосоме определенную последовательность ДНК и определить область взаимодействия исследуемого белка относительно видимых хроматиновых структур или районов локализации других белков. Это дает исследователям мощный инструмент для изучения роли транс-регуляторных белков в глобальных изменениях транскрипционной активности, имеющих место в таких процессах, как дозовая компенсация или гормональная индукция метаморфоза дрозофилы.
Целью данной работы было выявление закономерностей распределения в политенных хромосомах дрозофилы транс-регуляторных белков BR-C - продуктов ключевого гена экдизонового каскада, и белков MSL (Male-Specific-Lethal), обеспечивающих гипер-транскрипцию Х-хромосомы гетерогаметного пола дрозофилы. Для понимания роли разных белков группы BR-C в процессе гормонально-индуцируемого изменения транскрипционной активности в ходе метаморфоза мы предполагали исследовать стадия- и локус-специфичные особенности связывания этих белков с хроматином. Анализ локализации в хромосомах белков MSL в норме и под воздействием определенных факторов был направлен на решение некоторых вопросов, касающихся Х-специфичного взаимодействия комплекса с хроматином и его участия в регуляции транскрипции X-сцепленных генов.
Были поставлены следующие конкретные задачи:
Провести анализ локализации белков Broad-Complex в политенных хромосомах личинок третьего возраста и в момент формирования пупариума с использованием антител против домена, общего для всех белков данной группы, и против доменов, характеризующих отдельные изоформы.
Выяснить, коррелирует ли экдизон-нечувствительный период на стадии предкуколочного развития с временной утратой связи белков Broad-Complex с хроматином.
Проанализировать этапы взаимодействия белков MSL с сайтами-мишенями на X-хромосоме в условиях наличия в ядре нефункционального комплекса или сниженных количеств функциональных белков.
Исследовать случаи аутосомного связывания белков комплекса дозовой компенсации (ДК) и факторы, влияющие на данный тип взаимодействия белков MSL с хроматином.
Сравнить паттерны локализации в хромосомах белков комплекса дозовой компенсации, белков ISWI и JIL1, задействованных в реорганизации хроматина в ходе транскрипции, и гистона Н4, ацетилированного по 16-му остатку лизина.
Проанализировать распределение в политенных хромосомах самцов и самок дрозофилы РНК-геликазы MLE.
Научная новизна. Впервые проведен анализ распределения разных изоформ BR-C в политенных хромосомах слюнных желез D. melanogaster с использованием антител против разных доменов белков этой группы. Показано, что в состав хроматина политенных хромосом даной ткани входят все известные формы белков BR-C. Характер распределения по хромосомам белков данной группы предполагает их участие в регуляции транскрипции большинства генов, активных в ходе метаморфоза.
Цитологически подтверждено существование на Х-хромосоме сайтов повышенной аффинности к комплексу ДК. Получены данные, свидетельствующие об основной роли данных сайтов на первых этапах взаимодействия комплекса с Х-хромосомой. Выдвинуто предположение, что дальнейшее распространение комплекса по целой хромосоме не является простейшим последовательным сайт за сайтом связыванием с районами, расположенными рядом с сайтами его первичной нуклеации.
Проведен полный анализ аутосомной локализации белков MSL. На основании полученных результатов сделан вывод о наличии на всех хромосомах множества сайтов, аффинных к анализируемому белковому комплексу. Количество комплексов ДК в ядре, по- видимому, является критичным для корректного, хромосомо-специфичного, взаимодействия с хроматином.
Впервые проанализирована локализация комплекса ДК относительно транскрипционно-активных районов Х-хромосомы и относительно сайтов локализации белков ЛЬ 1 hISWI.
Практическая ценность. Проведенные исследования локализации в политенных хромосомах дрозофилы белков BR-C и комплекса ДК позволяют решить некоторые вопросы, касающиеся механизма действия транскрипционных факторов, участвующих в регуляции экспрессии множества генов в экдизоновом каскаде и в хромосомо-специфичной регуляции генов у самцов дрозофилы. Полученная информация важна в понимании функций белковых комплексов, отвечающих за глобальные процессы генной регуляции у эукариот. Апробация работы. Основные результаты данной работы были представлены в стендовых сообщениях на Всероссийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра, (19-21 октября 1999г., Санкт-Петербург, Россия); на Международном симпозиуме по исследованию инактивации Х-хромосомы у млекопитающих (6-12 сентября 1999г., Новосибирск, Россия); на 14th International Chromosome Conference (4-8 сентября 2001г., Wurzburg, Germany); на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (2002). Публикации. Alekseyenko А.А., Belyaeva E.S., Demakova O.V., Kotlikova I.V., Noethiger R., Zhimulev IF. Dosage compensation and manifestation of intercalary heterochromatin characteristics in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster Ih Abstracts of International Symposium on X chromosome Inactivation in Mammals - Novosibirsk. 1999. P. 94-95.
Котликова И.В., Демакова O.B., Жимулев И.Ф. Особенности локализации белков дозовой компенсации на политенных хромосомах Drosophila melanogaster II Цитология. 2000. Т. 42. С. 288-289.
Алексеенко А.А., Беляева ЕС, Демакова О.В., Котликова И.В., Жимулев И.Ф. Явление дозовой компенсации и проявление свойств интеркалярного гетерохроматина в политенных хромосомах Drosophila melanogaster II Цитология. 2000. Т. 42. С. 256-257.
ПохолковаГ.В., Демакова О.В., Котликова И.В., Мюга Б., Перроне Ф., Гонзи-Требуль Г., Беляева Е.С., Лепезант Ж.А., Жимулев И.Ф. Изменение активности пуфов у мутантов по Broad-Complex ключевому гену в каскаде генной активности, индуцированной стероидным гормоном экдизоном у дрозофилы. Цитология. 2000. Т. 42. С. 302. Kotlikova I.V., Demakova O.V., Kelley R.L., Kuroda M.I., Zhimulev IF. The spreading of Dosage Compensation Complex (DCC) on the X-chromosome of Drosophila melanogasterll Chromosome Research. 2001. V. 9, SI, P. 123. Alekseyenko A.A., Demakova O.V., Belyaeva E.S., Makarevich G.F., Kothkova I.V., Nothiger R., Zhimulev I.F. Dosage compensation and intercalary heterochromatin in X chromosomes of Drosophila melanogaster II Chromosoma. 2002. V. 111(2). P. 106-113 Gonzy G., Pokholkova G.V., Peronnet F., Mugat В., Demakova O.V., Kotlikova I.V., Lepesant J.A., Zhimulev I.F. Isolation and characterization of novel mutations of the Broad-Complex, a key regulatory gene of ecdysone induction in Drosophila melanogaster II Insect. Biochem. Мої. Biol. 2002. V.32(2). P. 121-132 Demakova O. V., Kotlikova I. V., Gordadze P. R., Alekseyenko A. A., Kuroda M. I., Zhimulev I. F. The MSL complex levels are critical for its correct targeting to the chromosomes in Drosophila melanogaster II Chromosoma. 2003. V. 112 (3). P.
Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 263 ссылки. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 33 рисунка и 11 таблиц.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Цитологический анализ иммуноокрашенных препаратов линий с дефицитом/избытком комплекса ДК проводился совместно с О. В. Демаковой.
Благодарности. Автор считает своей приятной обязанностью выразить благодарность О.В. Демаковой, под непосредственным руководством которой была выполнена данная работа. Автор благодарен И.Ф. Жимулеву за осуществление общего руководства, Г.В. Похолковой и Е.С. Беляевой за неоценимую помощь при написании данной работы и моральную поддержку, С.А. Демакову за помощь при выполнении гибридизации in situ и ценные советы. Автор также благодарен всем сотрудникам лаборатории молекулярной цитогенетики за то, что они есть и всегда готовы помочь словом или делом. Особую благодарность автор выражает нашим зарубежным коллегам из Франции - J-A. Lepesant и США - М. Kuroda, R. Kelley, P. Gordadse и A. Alekseenko, предоставившим в наше распоряжение необходимые для исследования антитела, линии мух, а также информацию и помощь при написании статей.
Список использованных сокращений
ДК - дозовая компенсация п.н. - пар нуклеотидов т.п.н. -тысяч пар нуклеотидов нм - нанометр CES - chomatin entry sites PS -puff stage
ISWI - Imitation Switch NURF - nucleosome remodeling factor ACF - ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor CHRAC - chromatin accessibility complex TF - transcription factors MLE {mle) - maleless MSL (msl) - male-specific lethal MOF (mqf) - male absent of the first SXL (Sxl) - Sex lethal roX - RNA on the X BR-C (Br-Q - Broad-Complex H4AcLysl6 - гистон H4, ацетилированныи по 16-му остатку лизина
Комплекс дозовой компенсации
Два открытия легли в основу понимания возможных механизмов действия MSL-комплекса, катализирующего глобальные изменения транскрипции генов целой хромосомы: обогащенность Х-хромосомы самца специфически модифицированной формой гистона Н4 (Turner et al., 1992; Bone et al., 1994), и ацетилтрансферазная активность, выявленная у MOF субъеденицы комплекса (Hilfiker et al., 1997; Gu et al., 1998).
На препаратах политенных хромосом слюнных желез личинок третьего возраста два гомолога Х-хромосомы у самок выглядят не толще единственной Х-хромосомы самца, которая, однако, значительно более диффузна по своей структуре (Dobzhansky, 1957). Данное наблюдение отражает структурные различия в упаковке хроматина Х-хромосомы у самца и самки дрозофилы.
Иммуноокрашивание антителами, специфически узнающими различные ацетилированные формы гистона Н4, выявило уникальную обогащенность Х-хромосомы самцов дрозофилы Н4, ацетилированным по 16-му лизиновому остатку - Н4Ас16 (Turner et al., 1992). Было показано, что паттерн распространения данного модифицированного гистона вдоль Х-хромосомы практически полностью соответствует распространению по хромосоме MSL-комплекса (Bone et al., 1994). Открытие гена mof и характеристика его продукта подтвердили участие именно комплекса ДК в специфическом ацетилировании гистона Н4. MOF относится к MYST-семейству ацетилтрансфераз и демонстрирует высокую гомологию с другими подобными белками у дрожжей (SAS2, SAS3, ESA1) и у человека (MOZ, ТірбО) (Hilfiker et al., 1997; Sanjuan and Marin, 2001). Анализ структуры белка выявил три функциональных домена - ацетилтрансферазный, С2НС/Н домен цинковых пальцев, обнаруженный и у всех других MOF-подобных белков, и хромодомен (Hilfiker et al., 1997). Как было показано, С2НС/Н домен отвечает за связывание MOF с глобулярной частью нуклеосомы и с N-концевым доменом гистона Н4 - субстратом данного фермента (Akhtar, Becker, 2001). Ацетилтрансферазная активность белка была подтверждена in vitro: иммуноочищенный комплекс ДК, включающий MOF, специфически ацетилировал гистон Н4 по 16-му лизиновому остатку (Smith et al., 2000). В дрожжевых системах данная модификация приводила к активации транскрипции модельных генов (Akhtar, Becker, 2000). Таким образом была продемонстрирована непосредственная связь механизмов действия комплекса ДК с модификацией гистонов.
Помимо MOF, нарушение функций которого ведет к гибели мутантных самцов, с MSL-комплексом взаимодействует еще один фермент, способный модифицировать гистоны. Иммуноокрашивание политенных хромосом антителами на протеинкиназу JTL1 выявило обогащенность данным белком Х-хромосомы самцов дрозофилы (Jin et al., 1999). Позднее было показано, что JTL1 колокализуется с MSL-комплексом и молекулярно взаимодействует с составляющими его белками в экспериментах по коиммунопреципитации (Jin et al., 2000). В отличие от других белков комплекса, исключая MLE, данная киназа выявляется, на всех хромосомах, как у самцов, так и у самок, демонстрируя Х-специфичность только при наличии функционального комплекса ДК (в норме у самцов и в случае эктопической экспрессии MSL2 у самок). In vitro JTL1 фосфорилирует гистон НЗ по 10-му остатку серина (Jin et al., 1999, Wang et al., 2001). Поскольку у млекопитающих данная модификация НЗ связана также с его ацетилированием, предположили, что подобная связь может быть выявлена и у дрозофилы. Действительно, антитела, специфически узнающие фосфо-ацетилированную форму гистона НЗ, преимущественно локализовались на Х-хромосоме самца (Wang et al., 2001). Следовательно, в механизме ДК может быть задействован целый ряд модификаций гистоновых белков, что хорошо вписывается в изложенную ранее (раздел 1.1.2) гипотезу "гистонового языка" как регулятора транскрипционного процесса. Специфическое ацетилирование и фосфорилирование гистонов может или непосредственно облегчать работу транскрипционной машины РНК-полимеразы с Х-хромосомными генами, или лежать в основе каскадных изменений структуры хроматина другими комплексами, непосредственно ремоделирующими хроматин и регулирующими транскрипцию. В любом случае предполагается, что дискретная локализация комплекса ДК и модифицированных форм гистонов, наблюдаемая на политенной Х-хромосоме (порядка 200 сайтов), достаточна для того, что бы изменить транскрипцию по всей ее длине. Исследователи полагали, что подобное возможно в случае, например, локальных изменений структуры хроматина в промоторных областях транскрибируемых генов, однако анализ распределения AcH4Lysl6 формы гистона относительно последовательностей дозовокомпенсируемых генов выявил, что они концентрируются, в первую очередь, в середине и/или в 3 области транскрипционной единицы, а не в промоторных областях (Smith et al., 2001). Следовательно, как полагает Е. Smith с соавторами, транскрипция генов может усиливаться за счет облегчения процесса элонгации и ускорения терминации транскриптов (там же). Таким образом, вопрос о молекулярных механизмах дозовой компенсации остается открытым. Еще один компонент комплекса ДК с ферментативной активностью - белок MLE. На данный момент его роль в механизме дозовой компенсации не ясна. Как рассматривалось выше, MLE демонстрирует высокую гомологию с РНК-геликазой А у млекопитающих. Предполагается, что РНК-геликаза А может участвовать в различных транскрипционных и пост-транскрипционных процессах. Так, было показано, что она обеспечивает взаимодействие некоторых белков, участвующих в регуляции транскрипции, с комплексом РНК-полимеразы П (Nakajima et al., 1997; Anderson et al., 1998; Aratani et al., 2001) и, кроме того, способна непосредственно взаимодействовать с последовательностями внутри промоторной области гена pl6(INK4a), влияя на его активность (Myohanen, Baylin, 2001). Эволюционная консервативность аминокислотного состава и биохимических особенностей РНК-геликазы А у млекопитающих и MLE у дрозофилы может свидетельствовать и о сходстве (консервативности) их биологических функций. Однако данные, подтверждающие или опровергающие это предположение, отсутствуют. 1.2.5 Почему X?
Одной из наиболее интересных проблем ДК является ее уникальность для одной из хромосом генома. Наиболее простым объяснением этому могло бы служить наличие на X-хромосоме специфичных с/5-регуляторных последовательностей, детерминирующих данную функцию. Долгое время предполагалось, что подобные последовательности многочисленны и, подобно энхансерным элементам, действуют на транскрипцию индивидуальных генов (обзор: Baker et al., 1994). Анализ нуклеотидного состава Х-хромосомы выявил обогащенность некоторыми повторенными последовательностями; в частности, три динуклеотидных повтора, CA/TG, CT/AG и C/G, представлены на Х-хромосоме в значительно более высокой степени, чем на аутосомах (DiBartolomeis et al., 1992). Однако нет никаких доказательств их участия в ДК. Основные попытки выявить специфичные для ДК с/5-регуляторные последовательности сводились к анализу индивидуальных генов и их окружения с помощью Р-элементной трансформации (обзор: Baker et al., 1994). В целом, дозовая компенсация трансгенов, содержащих Х-хромосомные гены и встроенных в аутосомы, варьировала в значительных пределах или совсем не наблюдалась, как и в случае инсерций аутосомных фрагментов на Х-хромосому (обзоры: Lucchesi, Manning, 1987; Baker et al., 1994), что предполагало значительное влияние на процесс ДК хромосомного окружения. Инсерций транспозона, содержащего ген mini-white, в различные сайты на X-хромосоме демонстрировали как полную ДК, так и сверх-ДК; последняя, в случае градуального удаления последовательностей с 5 конца гена переходила в полную и затем в частичную ДК (Qian, Pirrotta, 1995). Полный анализ этих событий, а также дозовой компенсации гена mini-white в случае инсерций в аутосомы, позволили авторам сделать вывод о том, что для ДК гена необходимы как нормальное Х-хромосомное окружение, так и многочисленные сг-у-регуляторные элементы в зоне промотора и в кодирующей области. Аналогичные результаты были получены и для других Х-сцепленных генов: ДНК-последовательности, влияющие на их ДК, выявлялись как в пределах гена, так и во фланкирующих последовательностях и на значительном от них расстоянии (обзор: Baker et al., 1994). Однако попытки выявить гомологию между такими последовательностями не увенчались успехом (там же). Не было выявлено существенных различий и при анализе последовательностей гена Hsp82, локализованного на Х-хромосоме у D. pseudoobscura и на аутосомах у трех других видов дрозофилы (Blackman, Heselson, 1986).
Приготовление ДНК зондов
В качестве зонда использовали пробы ДНК гена white, меченые Digoxigenin-11-dUTP. (Фирма Boehringer Mannheim). Железы извлекали из личинок 3-го возраста в физиологическом растворе Эфрусси-Бидла (7.5 г NaCl, 0.35 г КС1, 0.21 г СаСЬ віл воды). Железы фиксировали 2-3 мин в 45% уксусной кислоте и раздавливали под покровным стеклом. Далее препарат замораживали в жидком азоте и скалывали покровное стекло. Препараты обезвоживали в 96% этаноле 2 раза по 5 мин, после чего высушивали на воздухе. Препараты политенных хромосом инкубировали при 65 С в 2xSSC в течение 30 мин, промывали 2 раза по 5 мин в 2xSSC при комнатной температуре и денатурировали в 0.07 М NaOH, 2xSSC 1.5 мин при комнатной температуре. Далее, препараты проводили по холодным спиртам по 10 мин в каждом: 70%, 80% и 96% и высушивали на воздухе. Гибридизацию проводили во влажной камере при 37 С 12 часов в буфере состава: 10% декстран сульфат, 5xSSC и 50% деионизованный формамид. После гибридизации удаляли покровные стекла и препараты промывали 3 раза по 15 мин в 0.2xSSC при 42 С, потом помещали в раствор А состава: 2% Blocking reagent (Boehringer Mannheim), 0.1% Triton X-100 (Serva) в 4xSSC на 30 мин при 37 С. На препараты наносили по 25 мкл раствора А с Anti-Digoxigenin - POD (Boehringer Mannheim) (200 : 1) и инкубировали 30 мин при 37 С, после чего промывали в трех сменах 4xSSC, 0.1% Triton X-100 по 5 мин при 42 С в темноте. Детектирование проводили по протоколу, предложенному фирмой Boehringer Mannheim. Препараты окрашивали реактивом Hoechst и анализировали под микроскопом.
Слюнные железы выделяли в растворе Эфрусси-Бидла, содержащем 1 % неионного детергента Nonidet-P40 (NP40) или 1% неионного детергента Tween-20. Через 1-3 минуты железы переносили в формальдегидный фиксатор (0.1 М NaCl, 2mM КС1, lOmM NaP04, 1% NP40 (1% Tween-20), 2% формальдегид) на 40-50c. Затем железы помещали в уксусно-формальдегидный фиксатор (45% уксусная кислота, 3.2% формальдегид) на 1 минуту и давили в 45% уксусной кислоте. Фиксаторы использовали охлажденными во льду.
Препараты для окрашивания антителами против гистонов изготавливали согласно следующему протоколу. Слюнные железы выделяли в растворе РВТ (PBS 137mM NaCl, ЗтМ КС1, 8тМ NaH2P04 и 2тМ КН2РО4, 0.1% Tween-20). Далее фиксировали в формальдегидном фиксаторе (0.1 М NaCl, 2mM КС1, ЮтМ NaP04,l% Tween-20, 2% формальдегид) 4-5 минут. Затем железы помещали в уксусно-формальдегидный фиксатор (45% уксусная кислота, 3.7% формальдегид) на 3-4 минуты, после чего железы давили в том же растворе. Все фиксаторы использовали охлажденными во льду.
Далее, препараты замораживали в жидком азоте, и после удаления покровных стекол проводили через 96% спирты (две смены по 30 минут).
При анализе влияния теплового шока на локализацию белков в политенных хромосомах, личинок 3-го личиночного возраста отбирали и помещали на водяную баню, нагретую до 37 или 39 С, на время от 30 до 60 минут. Препараты готовили из личинок в течение одного часа после воздействия высокой температурой. В эксперименте по анализу локализации белков ДК на Х-хромосоме после теплового шока, выделенные из личинок слюнные железы помещали в раствор РВТ на 15 минут, после чего готовили препараты по стандартному протоколу. Для контроля использовали препараты, изготовленые из слюнных желез личинок, не подвергавшихся воздействию высокой температуры, и, как и в первом случае, помещенных в РВТ на 15 минут.
Обработка ядер РНК-зой проводилась согласно протоколу, использованному в работе L. Richter с соавторами (1996). Железы инкубировались в растворе PBS+PHK-аза А в течение 15 минут. Конечная концентрация РНК-зы в растворе составляла 0.5 мг/мл. 2.3.2 Иммуноокрашивание политенных хромосом
Для иммуноокрашивания препараты отмывали в охлажденном (4С) растворе РВТ (PBS 137mM NaCl, ЗтМ КС1, 8тМ NaH2P04 и 2тМ КН2Р04, 0.1% Triton Х-100 или Tween-20) 3 смены по 5 минут. Проводили предзабивку в блокирующем буфере (5% обезжиренное молоко, 10% эмбриональная телячья сыворотка, PBS+0.1%, Tween-20) 30 минут. Не допуская пересыхания препарата, наносили первые антитела в том же блокирующем буфере и инкубировали во влажной камере в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4С. Затем препараты отмывали в растворе РВТ (3 смены по 5 минут) и наносили раствор вторых антител, конъюгированных с флуорохромом, в блокирующем буфере. Инкубировали в течение 1-2 часов, затем стекла вновь отмывали в растворе РВТ (3 смены по 5 минут). В случае колоколизации двух различных антител на препарат наносили смесь первых антител (anti-MSL2 (rabbit) или anti-MOF (rabbit) и anti-MSL3 (Goat)) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Далее препараты инкубировали с вторыми антителами Donkey anti-Rabbit, конъюгированными с СуЗ флуорохромом в течение Ічаса при комнатной температуре. Препараты отмывали в растворе РВТ (3 смены по 5 минут), после чего наносили вторые антитела Rabbit anti-Goat (FITC) и инкубировали в течение часа. Затем стекла вновь отмывали в растворе РВТ (3 смены по 5 минут).
Перед анализом на препараты наносили антифейд, растворенный в глицерине (SlowFadeR, Нидерланды). Цитологический анализ и фотографирование проводили с помощью люминисцентного микроскопа Olympus (Japan). При фотографировании использовали пленку Konica VX 400. Кроме того использовалась цифровая камера Olympus и соответствующее програмное обеспечение. Компьютерная обработка результатов проводилась с использованием пакетов программ Adobe и Corel.
При картировании определенных районов связывания белков в каждом случае использовали не менее 5 особей, при этом количество проанализированных ядер составляло порядка 100. Антитела использовали в разведениях, рекомендованных исследователями или фирмами, предоставившими их в наше распоряжение. Для антител против белков ДК и модифицированной формы гистонов разведения составляли 1:100-1:200. Для антител против белков Вг-С 1:300 - 1:400 (против изоформ) и 1:2000 против корового домена. Стандартные разведения для вторых антител составляли 1:150, за исключением антител Rabbit anti Goat, конъюгированных с FITC (Sigma), которые использовались в разведениях 1:400.
Связывание белков дозовой компенсации с Х-хромосомой в условиях дефицита в ядре полного функционального комплекса
Анализируя паттерн распространения белков ДК на Х-хромосоме самок, несущих трансген msl2, у которого удалены или модифицированы сайты связывания с белком SXL, R.Kelley отметил, что при снижении в ядрах количества белка MSL2, ключевого фактора для формирования комплекса, последний перестает собираться по всей хромосоме и демонстрирует дискретный характер связывания (Kelley et al., 1997).
Дискретный паттерн, с одной стороны, может быть случайным и варьировать от ядра к ядру, с другой - закономерным, и отражать особенности взаимодействия полного функционального комплекса с хроматином Х-хромосомы. В этом случае природа дискретного связывания белков MSL в условиях дефицита комплекса ДК может определяться разной аффинностью к ним сайтов-мишеней на Х-хромосоме. Чтобы разобраться в данном вопросе, мы проанализировали серию трансгенных и мутантных самок, у которых количество эндогенного или эктопического белка MSL2 значительно варьировало (таблица 3.3). Подобный анализ невозможно провести на самцах, так как снижение у них количества комплекса ДК сильно влияет на жизнеспособность. Линии для работы отбирались после предварительного анализа паттерна локализации на X-хромосоме комплекса белков ДК. Иммуноокрашивание проводилось антителами против субъединиц MSL1 или MSL2. Для одной из линий (SXB2/TM3) было проведено иммуноокрашивание антителами против модифицированной формы гистона Н4, подтверждающее наличие функционального комплекса ДК в районах локализации антител против MSL2/MSL1 димера.
В таблице 3.3 представлена информация по основным линиям, использовавшимся в данной работе. Все линии были условно разделены на три группы. В первой группе количество MSL2 столь незначительно, что он связывается только с несколькими районами (1-20) на Х-хромосоме (линия SXB1 и "самочьи" ядра трансгетерозигот SxlFI/Sxrv ). Во второй группе белок детектируется примерно в 40-60 районах (SXB2/TM3), и в третьей паттерн локализации белков в разной степени приближен к наблюдаемому у самцов (NOPU, SXB2, SXB1-2, SXB1-2/TM3, "самцовые" ядра транс-гетерозигот Sxf/Sxf1, msl3p[w+,H83M2-61/TM3], yw;[w+H83M2-61]/+). В сравнительном анализе также использовались данные по локализации комплекса на Х-хромосоме самцов линии Oregon-R. Проведенный Western-анализ позволил приблизительно оценить количество белка MSL2 в некоторых анализируемых линиях (Demakova et al., in press).
Как видно из таблицы 3.3, минимальное количество белков комплекса детектировалось в линии SXB1 и в "самочьих" ядрах мозаиков по гену Sxl. В "самочьих" ядрах доминирует слабый аллель Sxf"1 (Gorman et al., 1993). Ранее считалось, что в этих ядрах трансляция гена msl2 регулируется слабым аллелем, аналогично нормальным самкам, и белок MSL2 не нарабатывается (там же). Однако иммуноокрашивание выявило в таких ядрах незначительные количества данного белка, который локализовался на Х-хромосоме в 1-15 районах (рис. 3.5, e-f). Как показал анализ 50-60 таких ядер у 7 особей, белок выявлялся в районах 1С(2), 2F(2), 3F(2), 5С, 7А(2), 7Е, 8А, ЮС, ПА, 11BD, 12F, 13А, 13D, 14F, 16D, 17F, 19F. Все эти районы являются сайтами повышенной аффинности к неполному комплексу (таблица 3.2). Наиболее мажорными и часто встречающимися были сайты в районах 17F, 13А, 13D и 7А. Данные сайты также детектировались и в линии SXB1, где минимальное количество белка MSL2, нарабатывающегося с трансгена, было достаточно для связывания только с 1-4 районами (рис. 3.5, g-h).
Таким образом, мы выделили минимальный набор хроматиновых сайтов (около 20), высоко аффинных к комплексу ДК. Четыре таких района (7А, 13A, 13D и 17F) демонстрировали максимальную аффинность к MSL-белкам. Среди указанных сайтов нет районов локализации генов roXl (3F) и roX2 (ЮС): сигналы в этих районах детектировались нами только тогда, когда количество MSL-комплексов в ядрах трансгетерозигот по гену Sxl было достаточным для связывания более чем с 7-10 районами. При этом сигнал в районе ЮС встречался чаще, чем в районе 3F. Современная модель сборки комплекса ДК на X-хромосоме отводит районам локализации генов гоХ ключевое место на начальном этапе взаимодействия MSL-белков с хроматином (Meller et al., 2000; Kageyama et al., 2001; Meller, Rattner, 2002). Предполагается, что в данных районах происходит встраивание некодирующих РНК в белковый комплекс, после чего зрелый комплекс ДК получает возможность связываться с остальными районами на хромосоме (Gu et al., 2000; Kageyama et al., 2001; Park et al., 2002). Следовательно, можно было ожидать, что именно районы 3F и ЮС будут проявлять максимальную аффинность к комплексу белков ДК в случае его дефицита в ядре. Однако мы этого не наблюдали. Таким образом, можно заключить, что взаимодействие с некоторыми районами Х-хромосомы не требует предварительного связывания комплекса с районами генов гоХ. Поскольку в нашем анализе мы использовали антитела только против белков MSL1 и MSL2, чтобы убедиться, что в единичных сайтах на Х-хромосоме собирается действительно полный комплекс, а не димер коровых белков, мы использовали в повторном анализе препаратов линии SXB1 антитела против MSL3 -периферийного белка комплекса ДК. Действительно, MSL3 также выявлялся в минимальном наборе сайтов (1-4), не включающих районы 3F и ЮС, предполагая, что связывание с ними всех белков MSL происходит независимо от районов экспрессии генов гоХ. К сожалению, мы не располагаем данными о наличии в составе этих комплексов РНК-компонентов.
Следующий этап нашего анализа локализации на Х-хромосоме полного функционального комплекса в условиях его дефицита в ядре был связан с поиском фактов, подтверждающих или опровергающих существующую модель распространения комплекса по Х-хромосоме. Согласно данной модели (рис. 1.1), комплекс собирается в районах сайтов повышенной аффинности к белкам и затем последовательно, сайт за сайтом, распространяется в соседние районы.
Мы тестировали линии, продуцирующие количества белка MSL2, позволяющие комплексу собираться более чем в 60 районах на X. При этом часто паттерн был сходен с наблюдаемым у самцов. Анализируя по 5-6 хромосом для каждой такой линии, мы показали, что паттерн фактически не варьирует в пределах одной линии и в пределах ядер одной особи по количеству сайтов, однако иногда может варьировать в интенсивности окрашивания отдельных сайтов. Линии, в порядке возрастания количества комплекса в ядре и, соответственно, числа сайтов на Х-хромосоме, можно было расположить следующим образом: SXB2, SXB1-2, Sxf ]/Sxfvi , msl3p[w+,H83M2-61/TM3],yw;[w+H83M2-61]/+ - линия, несущая два трансгена msl2 и линия NOPU. Кроме того, мы синтезировали две гетерозиготные линии на основе SXB2 и SXB1-2. SXB2/TM3 линия давала уникальный паттерн, который практически полностью совпадал с выявленным нами набором CES (рис. 3.5,c-d). Функциональность комплекса в данных районах была подтверждена иммуноокрашиванием этой линии антителами против специфически ацетилированной формы гистона Н4 (H4AcLysl6), (рис. 3.6). Следовательно, нам удалось реально продемонстрировать, что полный и функциональный комплекс ДК в первую очередь взаимодействует с районами, известными как сайты повышенной аффинности к белкам ДК у некоторых мутантов по генам msl.
. Зависимость аутосомной локализации MLE от других белков комплекса
Анализ локализации антител против белка MLE показал, что характер распределения данного белка в политенных хромосомах идентичен у обоих полов, за исключением доминантного связывания белка с Х-хромосомой самцов (рис. 3.18). Районы на аутосомах, с которыми преимущественно взаимодействует MLE, находятся в пуфирующем состоянии. Кроме хорошо развитых пуфов, белок выявляется в малых пуфах и некоторых междисках. Антитела связываются равномерно со всем материалом пуфов, подобно антителам против РНК-полимеразы (Weeks et al., 1993). Незначительное количество аутосомных сайтов демонстрирует мажорное окрашивание антителами. Для некоторых таких сайтов удалось выявить зависимость от возраста личинки. Так, мажорный сигнал в районе 30А (рис. 3.18 f) детектируется на PS1-4 и далее пропадает.
Характер локализации MLE на Х-хромосоме самца существенно отличается от локализации на Х-хромосоме самки. В последнем случае Х-хромосома демонстрирует окрашивание, сходное с аутосомным (рис. 3.18 d). Подобные различия несомненно определяются локализацией белка в составе комплекса ДК. MLE колокализуется с другими белками комплекса по всей длине X, и теряет Х-специфичность в случае мутаций генов msl (Kuroda et al., 1991; Gorman et al., 1993). В то же время, нам было интересно узнать, сохраняется ли независимая от комплекса локализация MLE на Х-хромосоме самца. Ранее, используя антитела против коровых белков, мы продемонстрировали отсутствие комплекса ДК в некоторых районах Х-хромосомы, в том числе в пуфе ЗС11-12 (раздел 3.1.1). Однако антитела против MLE давали четкий сигнал в этом районе на ранних PS, когда пуф развит, и ген sgs4 активен в слюнных железах (рис. 3.19). Аналогичную картину мы наблюдали и для пуфа 16В. Таким образом, MLE, даже на Х-хромосоме самцов, сохраняет локализацию, не связанную с другими белками MSL.
Кроме плеч всех хромосом антитела также связывались с материалом хромоцентра (рис.. 3.18d
Данные, полученные U. Bhadra с соавторами (1999), предполагали зависимую от белков MSL3 и MSL1 локализацию MLE на аутосомах. Чтобы проверить это предположение, мы использовали самок, мутантных по генам msll и msl3 (гомозиготные по мутации генов msl1и msl3
Хорошо видна локализация белка MLE в пуфе ЗС (d) и отсутствие комплекса ДК в данном районе (Ь)самки линий w; msll1 /СуО; [w+H83M2-61] и msl3p red/ТМб, Tb соответственно). Использованные аллели генов msll и msl3 являются аллелями с полной утратой функций соответствующих белков (Chang, Kuroda, 1998; Bone et al., 1994). Ни одна из этих мутаций не приводила к каким-либо нарушениям локализации белка MLE на хромосомах, (рис. 3.20). В качестве контроля мы использовали самок-сибсов, гетерозиготных по мутации соответствующего гена.
По данным М. Kuroda, поликлональные антитела против С-концевого домена белка MLE при проведении Western-анализа могут узнавать некоторые другие белки как у самцов, так и у самок (1991). Это может приводить к кросс-реакциям антител с такими белками при иммуноокрашивании аутосом. Мы проверили такую возможность, используя для контроля самок, несущих в гомозиготе нуль-аллель мутации гена mle (mle /mle1). Такие самки имеют нормальную жизнеспособность, в отличие от мутантных по данному гену самцов. Как видно на рис.3.20, g., имеется незначительное фоновое связывание антител с хроматином всех хромосом. Кроме того, детектируется слабый сигнал в хромоцентре. Таким образом, в целом антитела являются достаточно высоко специфичными именно к анализируемому белку. Однако связывание данных антител с хромоцентром, по крайней мере частично, обусловлено кросс-реакцией с гомологичными белками.
Белки, имеющие, подобно MLE, локализацию в районах активной транскрипции, обычно анализируются в системе теплового шока: стрессового фактора, кардинальным образом изменяющего локализацию на хромосомах РНК-полимеразного комплекса и ряда транскрипционных факторов.
После теплового шока белки MLE сохраняли свою локализацию в пуфах развития и междисках. Возможно, это связано с тем, что общая длительность воздействия высокой температурой в данных экспериментах не превышала 30 минут, что, предположительно, не ведет к полному прекращению транскрипции в ядре (Ashburner, Bonner, 1979; Vazquer et al., 1993). Вследствие воздействия высокой температуры белок MLE выявлялся также в развивающихся и развитых пуфах теплового шока (рис. 3.20 Ь). Развитие данных пуфов вызвано активностью генов теплового шока, участвующих в ответе на стресс. У D.melanogaster подобные пуфы возникают в районах 93D, 95D, 87А и 87С. Однако, если РНК-полимераза в условиях теплового шока мажорно связывается со всеми этими пуфами (Jamrich et al., 1977), обеспечивая их высокую транскрипционную активность, то геликаза MLE демонстрирует стабильное мажорное связывание только с районом 87С (рис. 3.20 b, d). Иногда мажорный сигнал выявлялся также в районах 93D и 95D, но никогда в районе 87А (рис. 3.20 d).
Чем обусловлено подобное избирательное доминантное связывание с районом 87С? Известно, что пуфы 87А и 87С развиваются вследствие активности расположенных в данных районах кластеров генов hsp70 (Ish-Horowicz et al., 1979). Однако, в отличие от 87А района, 87С, кроме данного гена, включает так называемый «/-повтор, кодирующий non-coding hshRNA с неясной функцией (Lis et al., 1978; Sharma, Lakhotia, 1995). Возможно, что именно транскрипция данной РНК приводит к избирательному мажорному связыванию белка MLE с материалом пуфа. Чтобы проверить это предположение, мы использовали D. simulans, вид-сиблинг D.melanogaster, для которого было показано, что гены, расположенные в 87 районе кодируют белок, идентичный HSP70 D.melanogaster, однако последовательностей, гомологичных а/-повтору, в данном районе не было обнаружено (Lis et al., 1981). Действительно, при иммуноокрашивании политенных хромосом слюнных желез данного вида, мажорный сигнал в районе 87С не наблюдался (рис. 3.20 f), что свидетельствует о возможной связи белка MLE именно с транскриптами «/-повтора. Кроме пуфов теплового шока, белок выявлялся также в хромоцентре и иногда в ядрышке в виде гранул. Чтобы убедиться, что связывание MLE с хроматином в условиях теплового шока так же, как и в норме, обусловлено его РНК-связывающей, а не ДНК-связывающей активностью, мы провели обработку ядер РНК-зой (материалы и методы). Аналогично данным, полученным ранее М. Kuroda с соавторами для нормальных, не стрессовых условий (Richter et al., 1996), белок практически полностью терял связь с хроматином под воздействием РНК-зы.
