Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время трансгенные растения широко используются как модели для изучения физиологической роли генов, вовлеченных в процессы роста и развития растений при нормальных условиях жизнедеятельности и при воздействии стрессовых факторов, для изучения механизмов регуляции экспрессии генов, осуществляемой на различных уровнях, для поиска и изучения функциональной значимости регуляторных последовательностей геномов. Особый интерес представляет использование трансгенных растений для моделирования отдельных этапов метаболизма вторичных соединений растений, включая алкалоиды, фитогормоны, лигнин и другие важные соединения. Такие исследования важны как с фундаментальной, так и с практической точек зрения: например, для направленного изменения метаболических путей в растениях с целью синтеза в растительных клетках соединений, необходимых для решения важных социальных проблем в области промышленности, медицины, сельского хозяйства.
Цель исследования: изучить возможность направленного изменения метаболизма стероидных соединений в растениях с помощью переноса и экспрессии в них кДНК CYP11A1 животных, которая кодирует митохондриальный цитохром P450Scc-Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Сконструировать экспрессионный вектор для трансформации растений, в котором полноразмерная последовательность кДНК CYP11A1 находится под контролем конститутивного промотора 35S РНК CaMV.
-
Провести трансформацию растений табака полученным экспрессионным вектором.
-
Провести молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов табака.
-
Определить функциональную активность цитохрома P450Scc путем сравнительного определения продукта катализируемой им реакции -прегненолона - в контрольных и трансгенных растениях табака.
-
Изучить особенности метаболизма ряда других стероидных соединений (таких как прогестерон и брассиностероиды) в трансгенных растениях табака, экспрессирующих кДНК CYP11A1 цитохрома P450Scc животного происхождения.
Научная новизна. Впервые показано, что гетерологичный ген, кодирующий полноразмерную последовательность кДНК CYP11A1, экспрессируется в растениях табака с образованием функционально активного белкового продукта. Выявлено, что экспрессия гетерологичного гена CYP11A1 в трансгенных растениях приводит к формированию у них фенотипа, характеризующегося сокращённым периодом вегетативного развития (раннее цветение и созревание семенных коробочек), увеличенной биомассой и
повышенной продуктивностью (количество и качество семян). Впервые показано, что белковый продукт гена CYP11A1 животного происхождения интегрируется в стероидогенную систему растений, вызывая изменения в метаболизме стероидных соединений, что, по-видимому, и обусловливает формирование у трансгенных растений фенотипа, отличающегося от фенотипа контрольных растений.
Практическая значимость. Сконструированный экспрессионный вектор и разработанные методические подходы могут быть использованы для изменения метаболизма стероидных соединений в хозяйственно важных видах растений с целью направленного улучшения их полезных свойств.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях, конгрессах и съездах: III Съезд генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня 2004 г.; Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 24-26 ноября 2004 г.; Международная научная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 6-8 июня 2005 г.; 12th European Congress on Biotechnology, Copenhagen, Denmark, 21-24 Aug. 2005; 6th International Symposium "Recent Advances in Plant Biotechnology: From Laboratory to business", Ceske Budejovice, Czech Republic, 12-15 Sept. 2005; Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB 2008), Tampere, Finland, 17-22 Aug. 2008; FEBS Advanced Course «Cytochrome P450 systems: from structure to application», Kranjska Gora, Slovenia 23-28 Sept., 2008; V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 21-28 июня 2009 г.; V Международная научная конференция «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Алушта, 21-25 сентября 2009 г.; Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино, 28 сентября -1 октября 2009 г.
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 4 статьях в научных журналах и сборниках, 15 материалах и тезисах международных научных конференций. Получен один патент на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (| ЬР наименований), изложена на (5^ страницах машинописного текста, содержит ^ таблиц и Ч10 рисунков.
