Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение интерфазных ядер вьеівило пространственную упорядоченооть расположения хромосом. Вакную роль в фиксации трехмерной структуры ядра отводят прикреплениям хромосом к ядерной оболочке и эктопическим связям (Куличков, Еимулэв, 1976; Стегний, 1979, 1987,а,б, 1993; Shilov, Zhinfiulev, 1986; Глазков, 1988, а, б; Paddy et al., 1990; Нимулёв, 1992). Выяснилось, что хромосомы контактируют с периферией посредством специфических гетерохроматиновых локусов (Стегний, 1979, 1987а; Shilov, Zhimulev, 1986; Hochstrasser, Sedat, 1987,а,б; Стегний, Шарахова, 1991; Жимулёв, 1993). Одни прикрепления являются об-лигатныни и очень прочными, другие - высокочастотными и слабими (Груздев, Кикнадзе, 1970; Quick, 1980; Hochstrasser et al., 1986). Реорганизация архитектоники ядер, происходящая в ходе онто- и филогенеза, была впервые обнаружена у малярийных комаров (Стегний, 1979, 1987,а,б). Исследования ядер соматических тканей у дрозофилы выявили тканевую специфику во взаимоотношениях менду хромоцентрсм. и периферией (Hochstrasser, Sedat, 1987, а). При анализе ядер генеративной ткани у дрозофил были обнаружены ткане- и видсспецифичные особенности взаиморасположения политенных хромосом (Стегний, Вассерлауф 1991,а,б, 1994). Отсутствие локального хромоцентра (Стегний, Вассерлауф, 1991,а) и политенизация блоков прицентромерного гетерохроиаткна (Mal'oeva, Zhimulev, 1993; Mal'ceva et al., 1995) в псевдопита-ющих клетках яичников D.melanog-aster позволяют использовать генеративную ткань в качестве удобной модели для изучения прикреплений политенных хромосом к ядерной оболочке: Очень вероятно, что реорганизация хромосомно-ламинных контактов, приводящая к изменении архитектоники ядра, может иметь отношение к механизмам тканевой дифференцировки и видообразования (Стегний, 1993). В связи с этим интересно выяснить, что происходит в месте ісонтакта хромосомы и ядерной оболочки на молекулярном уровне. Одни авторы считают, что белки, участвующие в ісомпактизации ДНК гетерохроматина (Will, Bautz, 1980; Jaiies, Elgin, 1986; James et al., 1989), имеют сродство к компонентам мембран и, таким образом, обеспечивают прикрепление к ним хромосом (Жкмулев, 1993). Другие полагают, что хромосомы прикрепляются за счет
спаривания тандемных повторов ДНК гетерохроматина в полимерной ламинной сети ядерной оболочки (Hochstrasser, Sedat, 1987,6; Hochstrasser et al., 1988). Поэтому наиболее актуальной является проблема существования в контактирующих с оболочкой хромосомных локусах специфических белков или последовательностей ДНК, непосредственно связывающихся с периферией ядра.
Дели и задачи исследования. Настоящая работа преследовала две цели: 1)получение и молекулярно-цитогенетический анализ ДНК из участков прикреплений хромосом к ядерной ламине; 2) выявление тканеспецифичных особенностей контактирования политенных хромосом с ядерной оболочкой в генеративной ткани у D.melano-gaster. Были поставлены следующие конкретные задачи.
-
Выделить и клонировать ДНК, ассоциированную с фракцией ядерных ламин.
-
Провести Са/эерн-дот-блот анализ ламинной ДНК.
-
Определить нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов и выявить мотивы, способные связываться in vitro с ламином.
-
Оценить хромосомную локализацию ламинных клонов относительно районов, контактирующих с ядерной периферией.
-
Оценить локализацию ламинной ДНК относительно добавочных блоков прицентромерного гетерохроматина в генеративной ткани и выявить особенности в их молекулярной организации.
6. Изучить локализацию и морфологию районов облигатного
прикрепления политенных хромосом к ядерной оболочке в
псевдопитающих клетках яичников линии ctu11.
Научная новизна. В настоящей работе впервые клонирована и охарактеризована специфическая ДНК, ассоциированная с ядерной ламиной D.melanogaster. Впервые продемонстрировано, что новая умеренноповторяющаяся M/SAR (matrix/scaffold associated regions) -последовательность, специфически связывающаяся с ламином in vitro, представлена в геноме двумя различающимися по длине популяциями HindiII-EcoRI-фрагментов, локализуется преимущественно в хромоцентре и контактирует с ядерной оболочкой. Впервые показаны различия в молекулярной организации между добавочными блоками прицентромерного гетерохроматина в псевдопитающих клетках яичников линии otu11. Впервые Еыявлены тканеспецифичные особенности контактирования политенных хромосом с ядерной оболочкой в генеративной ткани.
Практическая ценность. Результаты работы имеют важное вна-чение для дальнейшего исследования механизмов пространственной упорядоченности хромосом и её реорганизации в ходе онто- и филогенеза. Получение фрагмента ДНК, специфически связывающегося с ядерной ламиной, позволит использовать его для Р-трансформации в геном D.melanogaster. Это даст возможность создавать новые прикрепления хромосом к оболочке и тем самым моделировать реорганизацию ядерной архитектоники.
Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены стендовым сообщением на VII Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом", Пущино, 1991; устным докладом и тезисами на 1-й Всесоюзной конференции по генетике насекомых, Москва, 1991; стендовым сообщением на VI съезде Общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова, Минск, 1992; устным докладом и тезисами на Региональной научно-практической конференции, Томск, 1994; стендовым сообщением и тезисами на 1-м съезде ВОГИС, Саратов, 1994; тезисами на конференции "The Nuclear Matrix: Involvement in Replication, Transcription, Gene Splicing and Cellular Regulation" (Keystone Symposia on Molecular & Cellular Biology), Hilton Head Island, South Carolina, 1995.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи 2 кратких сообщения и 5 тезисов. 4 статьи находятся в печати.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение собственных экспериментальных данных, обсуждение результатов исследования, выводы и список литературы. Работа изложена на 120 страницах, включая 2 таблицы и 30 рисунков.