Введение к работе
Настоящая работа посвящена молекулярно-генетическому изучению ло--куса длинного плеча хромосомы 8q24.1, являющегося "критическим" сегментом, повреждаемом при синдроме Лангера-Гндиона, и поиску полиморфных ДНК-маркеров для физического и генетического картирования гена множественной экзостозной хондродисплазии.
Актуальность темы. Физическое и генетическое картирование генома человека является фундаментальной проблемой. В настоящее время фрагментарно физически картированы все хромосомы человека. Картировано и изучается около 300 генов человека, многие из которых, при нарушении структуры и функционирования, сопровождаются патологическими проявлениями. Хромосома 8 человека содержит около 150 млн. пар оснований и составляет около 4% генома человека. Несмотря на довольно большие размеры, ее картирование значительно отстает от многих других. В последние 2 года усилия по молекулярно-генетическому изучению хромосомы 8 получили дополнительный импульс благодаря картированию на ней генов, ответственных за возникновение ряда заболеваний и, в частности, множественной экзостозной хондродисплазии (Wood et al.,1993). Участок длинного плеча хромосомы «q24.l по величине составляет.Ю-20 млн. пар нуклеотидов, но подробной физической и генетической карты пока не существует. Однако, данные клинико-цитогенетических исследований свидетельствуют о насыщенности данного участка структурными генами, участвующими в процессе эмбрионального развития человека. Об этом говорит выявляемая структурная патология этого хромосомного района, сопровождающаяся различными множественными врожденными пороками развития (МВПР) и некоторыми новообразовательными процессами. Одним из таких синдромальных МВПР является синдром Лангера-Гидиона (СЛГ), при котором всегда выявляется делецня хромосомы 8q24.l - наименьший участок перекрывания всех делеций составляет около 2.5 млн. пар оснований (Залетаев и др., 1987. 1990, Buhler.Malik, 1985, Hors-themke et at., 1991). Фенотип СЛГ представляет собой фенотнпнческую совокупность двух патологических состояний - трихо-рнно-фалангового синдрома I типа (ТРФС-1) и множественной экзостозной хондродисплазии (МЭХД), в отдельных случаях сопровождающихся аналогичной хромосомной патологией (Залетаев, 1990. Marchau et а!.. 1993). СЛГ, являясь синдромом сегментных анеусомий, пре::тавляет собой объе г для генетического картирования. СЛГ достаточно редок - около 80 описанных случаев, тип наследования не известен, но предполагается аутосом-
но-доминантный (3 семейных случая), ТРФС-1 встречаеся чаще - более 400 описаний, так же предполагается аутосомно-доминантный тип наследования (около 30 семейных случаев), МЭХЛ - достаточно распространенная патология, составляющая до 10% обращений в специализированные клиники (более 70% семейных случаев). Около 25% множественных экзостозов при МЭХД имеют тенденцию к трансформации во вторичную хондрому и хондросаркому (Волков, Меерсон,1979). Таким образом, картирование гена МЭХЛ и выявление мутаций в нем является социально значимой задачей по диагностике, профилактике и прогнозированию течения этого наследственного аутосомно-доминантного заболевания.
В основу исследования заложена стратегия "позиционного клонирования", для реализации которой необходима физическая карта конкретного хромосомного участка и наличие полиморфных ДНК-маркеров, с помощью которых можно обнаружить генетическое сцепление с болезнью в семьях.
Все, выше сказанное, определило цель и задачи предлагаемого исследования.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего иследования является молекулярно-генетическая характеристика района и поиск полиморфных ДНК-маркеров в районе хромосомы 8q24.1, повреждаемом при СЛГ, ТРФС-1 и МЭХД для физического и генетического картирования. Задачами исследования являются:
-
Характеристика космидных клонов, расположенных в "критическом" сегменте хромосомы 8q24.1 в отношении наличия микро- и минисател-литных последовательностей, умеренно повторяющихся последовательностей (Alu-. Крп- и других), СрО- богатых участков и белок-коди-рующих последовательностей;
-
Субклонирование космидных клонов для получения клонотеки ДНК-маркеров и их анализ на предмет информативного полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, микро- и минисателлитного полиморфизма;
-
Секвенирование отдельных субклонов для получения STS и изучение их на предмет ПДРФ и однонитевого конформационного полиморфизма;
-
Характеристика делеций хромосомы 8q24.l у пациентов с СЛГ и ТРФС-1 по длине с целью делеционного картирования..
-
Изучение семей с СЛГ, ТРФС-1 и МЭХД на предмет сцепления с выявленными полиморфными ДНК-маркерами.
Научная новизна. В ходе данной работы впервые проведена комплексная молекулярно-генети еская характеристика шести космидных клонов общей длиной около 210 т.п.н.. картированных в мало изученном
- 5 -сегменте хромосомы 8q24.І. Получены новые ДНК-зонды, имеющие ПДРФ и уникальные ДНК-зонды, пригодные для проведения дозовых блот-гибриди-зационных экспериментов при характеристике делеций по длине. Выявлена повторяющаяся диспергированная последовательность с плечевой локализацией на отдельных хромосомах. Получены новые STS для физического картирования хромосомы 8. В общей сложности секвенировано более 2 т.п.н. в исследуемом районе. Выявлен фрагмент ДНК, имеющий CpG-островок и открытую рамку считывания. С использованием полученных ДНК-зондов проанализированы семьи с СЛГ, ТРФС-І и МЭХД и гаплотипи-рованы хромосомы, несущие мутацию, приводящую к МЭХД.
Практическая ценность работы. Молекулярно-генетическая характеристика космидных клонов, локализованных в мало изученном районе длинного плеча хромосомы 8q24.1 является вкладом в изучение генома человека. Полученные STS, могут быть использованы для построения физической и генетической карты длинного плеча хромосомы 8. Полученное ДНК-зонды, имеющие полиморфизм, могут быть использованы для поиска генетического сцепления с геном, отвечающим за развитие множественных экзостозов у человека. Неполиморфные ДНК-зонды могут быть использованы для диагностики и характеристики микроструктурной хромосомной патологии в участке 8q24.1. Получен новый диагностически ценный полиморфный ДНК-зонд, позволяющий начать разработку процедур ДНК-диагностики.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных семинарах Института клинической генетики МГНЦ РАМН в мае 1993 г. и в апреле 1994 г., на III (1993 г.) и IV (1994 г.) Российских конференциях "Геном человека" в Черноголовке.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов" и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 20 рисунков. Список литературы включает 80 работ.