Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности Бильданова Лариса Леонидовна

Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности
<
Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Бильданова Лариса Леонидовна. Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.15 : Новосибирск, 2005 190 c. РГБ ОД, 61:05-3/1385

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 14

1.1. Значение отдаленной гибридизации мягкой пшеницы 14

1.2. Особенности гибридизации между видами ячменя и пшеницы 15

1.3. Генетический контроль скрещиваемости при отдаленной гибридизации у Thticeae 19

1.4. Эффекты ядерно-цитоплазматических взаимодействий у аллоплазматических линий пшеницы 23

1.5. Гены совместимости при отдаленной гибридизации 30

1.6. Генетический контроль цитоплазматическои мужской стерильности растений 33

1.6.1. ЦМС-обусловливающие митохондриальные гены 34

1.6.2. Ядерные гены, участвующие в контроле ЦМС 37

1.6.3. Механизм действия ядерных генов - восстановителей фертильности... 38

1.6.4. Ядерные гены Rf— восстановители фертильности у видов Triticeae 41

1.6.5. Гены Rf- клонирование in vitro 43

1.7. Наследование цитоплазматического генома у высших растений 44

1.8. Проявление гетероплазмии митохондриальной ДНК 47

1.9. Изменения ядерного генома, связанные с процессом отдаленной гибридизации 50

1.9.1. Геномные изменения, происходящие при аллоплоидизации отдаленных

гибридов 52

1.9.1.1. Изменения во фракции низкокопийных кодирующих последовательностей 54

1.9.1.2. Изменения во фракции низкокопийных некодирующих последовательностей 54

1.9.1.3. Изменения генов рибосомальных РНК 56

1.9.1.4. Изменения во фракции высокоповторенных последовательностей 58

1.9.1.5. Изменения, связанные с мобильными элементами 59

1.9.2. Эпигенетические изменения при полиплоидизации отдаленных гибридов

1.9.3. Избирательность интрогресии при отдаленной гибридизации 61

1.10. Использование методов, основанных на ПЦР, для анализа генома растений 63

1.9.1. Возможности метода RAPD для изучения растений гибридного происхождения 64

1.9.2. Метод случайно амплифицированных микросателлитных последовательностей (RAMPO) 67

1.9.3. Возможности использования SSR маркеров 69

Глава 2. Материалы и методы 72

2.1. Растительный материал 72

2.2. Выделение ДНК 75

2.2.1. Выделение ДНК растений с использованием протеиназы «К» 76

2.2.2. Экспресс-метод выделения ДНК растений 77

2.2.3. Выделение ДНК рекомбинантных плазмид методом щелочного лизиса 77

2.3. Условия ПЦР, RAPD-анализ и кроссгибридизация RAPD фрагментов, использованные в данной работе 78

2.4. Обработка образцов ДНК эндонуклеазами рестрикции 79

2.5. Электрофорез в агарозном геле 79

2.6. Вариант методики RAMPO, использованный для анализа аллоплазматических линий пшеницы в данной работе 79

2.7. Клонирование и анализ RAPD-последовательностей , 80

2.8. Саузерн-гибридизация с фрагментом мтДНК 80

2.9. Использование SSR-анализа для характеристики аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы 81

Глава. 3. Результаты 82

3.1. Результаты RAPD анализа аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы 3.1.1. Изучение RAPD спектров ячменя И. vulgare, Н. geniculatum и мягкой пшеницы Т. aestivum 82

3.1.2. Изучение RAPD спектров аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы Л-16(1)Р3, Л-17(1)F3, Л-79(10)Р3 и H-9F7 84

3.2. Клонирование и анализ de novo амплифицированной RAPD- последовательности линии Л-16(1)Рз 89

3.3. Кросс-гибридизация RAPD-фрагментов ячменя 92

3.4. Гибридизация RAPD спектров с микросателлитными мотивами (RAMPO).. 92

3.5. Анализ аллоплазматических линий мягкой пшеницы с различным проявлением признака фертильности методом RAPD 97

3.6. Секвенирование и анализ RAPD-фрагментов ячменного происхождения, выделенных из генома линии Л-79(10)F3 100

3.7. Выявление маркеров митохондриальнои ДНК Н. vulgare у аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы с различным проявлением самофертильности 101

3.8. SSR анализ геномного состава ячменно-пшеничных гибридов, их беккроссных потомков и аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы (И. vu!gare)-T. aestivum 106

3.8.1. Использование микросателлитных маркеров Н. vulgare 106

3.8.2. Использование микросателлитных маркеров 7". aestivum 109

3.8.2.1. Межсортовой полиморфизм мягкой пшеницы по SSR-маркерам 111

3.8.2.2. Анализ гибридов первого поколения Fi и беккроссов первого поколения с использованием SSR-маркеров Т. aestivum 112

3.8.2.3. Анализ беккроссов ВСз, ВС4 поколений и аллоплазматических рекомбинантных линий Л-16{1) и Л-17(1) с использованием хромосомоспецифичных SSR-маркеров Т. aestivum 112

3.8.2.4. Особенности реорганизации ядерного генома в процессе создания аллоплазматических рекомбинантных линий 114

3.9.3. SSR-анализ аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы n-79(10)F3 и Л-79(10)(3)Ре 115

Глава 4. Обсуждение результатов 119

4.1. Выявление присутствия генетического материала ячменя у ячменно- пшеничных гибридов первого поколения, их беккроссных потомков и аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum)-T. aestivum 119

4.2. Изменчивость последовательностей митохондриального генома у аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы в процессе восстановления фертильности 123

4.3. Особенности рекомбинации генетического материала сортов мягкой пшеницы Т. aestivum при беккроссировании ячмено-пшеничных гибридов и самоопылении аллоплазматических рекомбинантных линий 126

4.4. Возможности ипользования микросателлитных маркеров культурного ячменя Н. vulgare и мягкой пшеницы T.aestivum для SSR-анализа родственных видов 127

4.5. Изменчивость генома аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой

пшеницы (H.vulgare)-T.ae$tivum, выявляемая различными молекулярно-генетическими методами 129

Заключение 131

Выводы 136

Список литературы 138

Приложение 170

Введение к работе

Актуальность проблемы. Отдаленная гибридизация играет важную роль в процессе видообразования цветковых растений (Вавилов, 1960), а экспериментальное получение отдаленных гибридов представляет интерес при решении многих фундаментальных проблем биологии (Rieseberg et al., 2003) и практических задач селекции (Цицин, 1976). Так, изучение синтезированных в результате отдаленных скрещиваний гибридов позволяет выявлять особенности взаимодействия чужеродных геномов (Adams et al., 2003; Kovarik et al., 2005), механизмы несовместимости, обуславливающие изоляционные барьеры (Шулындин, 1978; Першина и др., 1998), и оценивать степень филогенетического родства между разными таксономическими группами (Burow et al., 2001). Кроме того, отдаленные гибриды являются модельными объектами в исследованиях закономерностей изменчивости геномов при формообразовании (Rieseberg et al., 2003; Joly et al., 2004). Амфиплоиды и интрогрессивные линии, создаваемые при межвидовой и межродовой гибридизации, используют в качестве нового исходного материала в селекции растений (Цицин и др., 1979; Махалин, 1986; Rabinovich, 1998).

У растений гибридного происхождения, начиная с первого поколения, на жизнеспособность и фертильность растений определяющее влияние оказывают ядерно-цитоплазматические взаимодействия, контролируемые генами, ответственными за совместимость чужеродных по отношению друг к другу ядерных и органельных геномов {Маап, 1992; Hossain et al., 2004).

Наиболее изученным фенотипическим проявлением ядерно-

цитоплазматического дисбаланса у растений является цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) (Conley, Hanson, 1995). Для преодоления стерильности отдаленных гибридов, в том числе обусловленной ядерно-цитоплазматическим конфликтом, используют два основных приема: удвоение числа хромосом и проведение возвратных скрещиваний гибридов с одним из родителей (Карпеченко, 1971; Цицин, 1976). При этом повторное беккроссирование гибридов с отцовским генотипом используют для создания аллоплазматических линий {ядерно-цитоплазматических гибридов), у которых в процессе продолжающихся возвратных скрещиваний происходит вытеснение материнского ядерного генома отцовским (Panayotov, 1980; Палилова, 1986). Аллоплазматические линии используются для исследования ядерно-цитоплазматических взаимодействий (Hattori et al., 2002; Siniavskaia et al., 2004) и

7 рассматриваются в качестве перспективных форм для селекции на устойчивость к биотическим стрессам (Силкова, Палилова, 1987; Орлов, 2001).

В настоящее время большое внимание уделяют роли митохондриального генома в проявлении ЦМС (Budar et al., 2003; Иванов и др., 2004) и вопросам наследования органелльных геномов у гибридных организмов (Havey et al., 1998; Синявская и др. 2003; Трубачеева и др., 2005). Обнаружено, что при отдаленной гибридизации эволюционно закрепленные механизмы передачи органельных геномов потомкам могут нарушаться (Hattori et al., 2002; Siniavskaia et al., 2004).

Вместе с тем, по данным современной литературы, при изучении этапов формообразования в процессе отдаленной гибридизации и полиплоидизации, как правило, проводят изучение изменчивости ядерных геномов, не акцентируя внимание на ядерно-цитоплазматических взаимодействиях (Rieseberg et al., 1996; Adams et al., 2004). С другой стороны, не изученными остаются и последовательные этапы реконструкции ядерных геномов при формировании аллоплазматических линий.

В этом отношении интерес для исследования преобразований ядерных и органельных геномов представляют беккроссные потомки ячменно-пшеничных гибридов разных комбинаций, на основе которых развитие получают как эуплоидные, так и анеуплоидные аллоплазматические рекомбинантные линии, характеризующиеся разным проявлением цитоплазматической мужской стерильности.

Цель и задачи исследования. Цель работы — изучение с использованием комплекса молекулярных методов особенностей реорганизации геномов у аллоплазматических рекомбинантных линий (Н. vutgare)-T. aestivum, формирующихся при беккроссировании ячменно-пшеничных гибридов Н. vutgare L. (2п-14) х Т. aestivum L. (2п=42) разными сортами мягкой пшеницы и характеризующихся разным проявлением фертильности.

Задачи исследования:

1. Проведение RAPD- и RAMPO-анализа эуплоидных (2п=42) аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы (Н. vu!gare)-T. aestivum с разным проявлением фертильности, образца аллоплазматической дополненной линии (Н. geniculatum)-T. aestivum (2n=43+t), видов ячменя Н. vutgare L, Н. geniculatum All. и мягкой пшеницы Т. aestivum L.

2. Клонирование и анализ первичной структуры RAPD-фрагментов генома ячменя, выявляемых у аллоплазматических линий мягкой пшеницы (Н. vu!gare)-T. aestivum, нестабильных по проявлению фертильности.З. Анализ последовательностей мтДНК у аллоплазматических рекомбинантных линий (И. vu!gare)-T. aestivum с различным проявлением фертильности.

4. Изучение структуры ядерных геномов ячменно-пшеничных гибридов И. vulgare L <2п=14) х Т. aestivum L. (2п=42) и особенностей их реорганизации в процессе беккроссирования и стабилизации аллоплазматических линий (Н. vulgare)-T. aestivum с использованием микросателлитных маркеров ячменя Н. vulgare и мягкой пшеницы Т. aestivum.

Научная новизна. Впервые для исследования использован подход, основанный на параллельном изучении особенностей ядерного и митохондриального геномов у аллоплазматических рекомбинантных линий с разным проявлением фертильности. Это позволило получить новые данные, значительно расширяющие представления об особенностях реорганизации ядерных и митохондриальных геномов в процессе формообразования и восстановления фертильности при отдаленной гибридизации растений. Впервые выявлены различия по структуре геномов между аллоплазматическими рекомбинантными линиями мягкой пшеницы (Н. vu!gare)-T. aestivum со стабильным и нестабильным проявлением фертильности.

С использованием RAPD-, RAMPO- и SSR-анализа установлено, что при беккроссировании ячменно-пшеничных гибридов Н. vulgare х Т. aestivum мягкой пшеницей вытеснение ядерного генома ячменя происходит к ВСз, кроме того, процесс беккроссирования и формирования аллоплазматических линий (Н. vulgare)-T. aestivum сопровождается реорганизацией ядерного генома пшеницы. По данным SSR-анализа у нестабильных по проявлению признака фертильности аллоплазматических рекомбинантных линий, по сравнению со стабильными линиями, процесс формообразования не завершен, что выявляется в виде изменения сочетания сортового материала пшеницы в процессе самоопыления.

Выявлена зависимость между присутствием в геноме аллоплазматических линий последовательности tMet-18S-5S отцовской (пшеничной) мтДНК, отсутствием последовательностей материнской (ячменной) мтДНК и особенностями проявления фертильности. Полное восстановление фертильности аллоплазматических рекомбинантных линий коррелирует с вытеснением последовательности tMet-18S-5S материнской (ячменной) мтДНК. Наблюдаемая у

9 аллоплазматических линий гетероплазмия по локусу tMet-18S-5S указывает на возможность нарушения материнского наследования мтДНК у потомков ячменно-пшеничных гибридов.

Практическая ценность. С применением методов RAPO и RAMPO впервые выявлены значительные различия между спектрами фрагментов ДНК ячменя и пшеницы, что позволяет рекомендовать эти методы для выявления чужеродной интрогрессии при гибридизации Hordeum L. и Т. aestivum L.

Метод RAMPO позволил выделить полиморфизм среди сортов пшеницы Т. aestivum L, это делает возможным его использование в молекулярно-генетических исследованиях, связанных с идентификацией различных сортов мягкой пшеницы Т. aestivum L.

Впервые показано, что RAPD-праймеры выявляют присутствие мтДНК в суммарной ДНК растений. Установлено, что последовательности НТЗ, НТ4, НТ5 и tMet-18S-5S могут применяться для обнаружения мтДНК Н. vuigare у гибридных генотипов, полученных с применением Н. vuigare в качестве родительской формы.

Впервые выявлены микросателлитные маркеры ячменя, которые могут быть использованы для SSR-анализа различных сортов пшеницы Т. aestivum L

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 11ой конференции EWAC, Новосибирск, 2000; всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений", Иркутск, 1999; Международной конференции "Genetic Collection, Isogenic and Alloplasmic Lines, Новосибирск, 2001; Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология", Москва, 2001; Международной конференции по отдаленной гибридизации, Москва, 15-17 декабря 2003; II конференции МОГиС, Москва, 2003; III съезде ВОГиС, Москва, 2004 и обсуждались на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (1998,2001,2004).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 15 работ, в том числе 5 статей в рецензируемых изданиях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 190 страницах печатного текста, включая 19 таблиц и 11 рисунков. Список цитированной литературы содержит 424 работы.

Благодарность. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (номера проектов 02-04-4816-а, 05-04-48600а,

10 руководитель проекта д.б.н. Л.А. Першина), Программы Президиума РАН «Геном растений» (руководитель Программы академик В.К. Шумный), Фонда Министерства Сельского и Лесного Хозяйства Германии (руководитель проекта к.б.н. Е.А. Салина). Автор благодарен сотруднице Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, д.б.н. Е.Д. Бадаевой за проведение цитогенетического исследования ряда аллоплазматических линий и сотрудничество при редактировании текста совместной статьи, сотрудникам ИЦиГ СО РАН Л.И. Беловой и Э.П. Девяткиной за создание исходного материала, М.В. Баклановой - за техническую поддержку. Автор признателен д-ру М. Родер за возможность использования SSR-маркеров и выполнения работы, связанной с SSR-анализом, в лаборатории картирования генов и геномов растений (ІРК, Гатерслебен, Германия).

Список работ, опубликованных по теме диссертиции. Статьи в рецензируемых изданиях: Бильданова Л.Л., Салина Е.А., Першина Л.А., Шумный В,К. 1999. RAPD-анализ

аллоплазматических линий пшеницы, полученных на основе ячменно-

пшеничных гибридов. ДАН 367: 697-701. Bildanova L.L.. Troubacheeva N.V., Salina Е.А., Pershina L.A. 2001. Molecular

changes in the genome of backcrossed progenies of barley-wheat hybrids. EWAC

Newsl. 11:92-94. Бильданова Л.Л.. Салина Е.А., Першина Л.А. 2002. Изучение беккроссных

потомков ячменно-пшеничных гибридов с использованием методов RAPD и

RAMPO, Генетика 38: 332-339. Бильданова Л.Л.. Салина Е.А., Першина Л.А. 2003. Изучение особенностей

рекомбинации ядерного генома у беккроссных потомков ячменно-пшеничных

гибридов Hordeum vulgare L (2n=14) x Triticum aestivum L. (2n=42) с

использованием SSR-анализа. Генетика 39: 1673-1679. Бильданова Л.Л., Бадаева Е.Д., Першина Л.А., Салина Е.А. 2004. Молекулярно-

генетический анализ и С-окрашивание хромосом аллоплазматических линий

мягкой пшеницы, полученных н основе беккроссных потомков ячменно

пшеничных гибридов Hordeum vulgare L (2n=14) x Triticum aestivum L (2n=42)

и различающихся no проявлению фертильности. Генетика 40:1668-77. Бадаева Е.Д., Першина Л.А., Бильданова Л.Л. 2005. Цито генетическое

исследование нестабильных по проявлению фертильности и

11 жизнеспособности аллоплазматических рекомбинантных линий (Н. vuIgare)-T. aestivum. Генетика (в печати).

Другие работы:

Бильданова Л.Л.. Трубачеева Н.В., Щербань А.Б., Салина Е.А., Першина Л.А., Шумный В.К. 1999. Молекулярный анализ гибридного генома аллоплазматических линий пшеницы. Материалы всероссийского симпозиума "Изучение генома и генетическая трансформация растений", Иркутск, с. 16.

Bildanova L.L.. Troubacheeva N.V., Salina Е.А., Pershina L.A. 2000. Molecular changes in the genome of backcrossed progenies of barley-wheat hybrids. Abstracts of the 11th EWAC Conference dedicated to the memory of O.I. Maystrenko, 24-28, July, 2000, Novosibirsk, Russia. P.88.

Бильданова Л.Л., Трубачеева H.B., Песцова Е.Г., Щербань А.Б. 2001. Молекулярный анализ ретротранспозон-зависимых изменений в геномах ячменно-пшеничных гибридов. Конкурс молодых ученых СО РАН 1997-1998 гг. Биологические науки. Сборник трудов. Институт цитологии и генетики СО РАН, 2001. С.7-10.

Pershina L.A., Numerova О.М., Belova L.I., Devyatkina E.P., Bildanova L.L., Troubacheeva N.V., Salina E.A. 2001. Alloplasmic lines of wheat T. aestivum L. with cytoplasm of barley H. vulgare L. In: Genetic Collection, Isogenic and Alloplasmic Lines. Proc. Intern. Conf. Novosibirsk. - 2001. P.98-100.

Бильданова Л.Л.. Трубачеева Н.В. 2001. Характеристика генома аллоплазматических линий пшеницы с использованием RAPD- метода. Тезисы международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений», 2-7 июля 2001 г., Институт растениеводства им. В.Я. Юрьева Украинской Академии аграрных наук, Харьков, с.18-19.

Бильданова Л.Л., Трубачеева Н.В. 2001. Изучение характера преобразований геномов аллоплазматических потомков ячменно-пшеничных гибридов при помощи RAPD-анализа. Тезисы международного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" Москва 18-21 ноября 2001г. Минск 22-24 ноября 2001 г. С. 172.

Pershina L.A., Numerova О.М., Salina Е.А., Bildanova L.L.. Troubacheeva N.V., Shumny V.K. 2001. The study of barley-rye, barley-wheat hybrids and production

12 different genotypes of alloplasmic lines of wheat using barley-wheat hybrids. Book of abstracts of 4th International Triticeae Symposium, Cordoba, Spain, P.122.

Першина Л.А., Нумерова O.M., Бадаева Е.Д., Белова ЛИ., Девяткина Э.П., Бильданова Л.Л., Салина Е.А., Шумный В.К. Создание и изучение аллоппазматических эуплоидных, аллоплазматических дополненных и замещенных линий мягкой пшеницы на основе ячменно-пшеничных гибридов. Сборник материалов международной конференции по отдаленной гибридизации, Москва, 15-17 декабря 2003 г.

Бильданова Л.Л., Салина Е.А., Першина Л.А. Особенности геномов беккроссных потомков ячменно-пшеничных гибридов Hordeum vulgare L. (2n=14) x Triticum aestivum L. (2n=42). Сборник материалов III съезда ВОГиС, Москва, 6-12 июня 2004. с. 152

Першина Л.А., Нумерова О.М., Белова Л.И., Девяткина Э.П., Трубачеева Н.В., Бильданова Л.Л.. Бадаева Е.Д., Салина Е.А., Шумный В.К. Реконструкция геномов пшеницы на основе отдаленной гибридизации с видами Hordeum L III съезд ВОГиС, Москва, 6-12 июня 2004. с.77.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ «ДНК — комплиментарная ДНК, полученная методом обратной транскрипции мтДНК - митохондриальная ДНК пн — пара нуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция тпн - тысяча пар нуклеотидов Трис-НСІ -Трис (гидроксиметил) аминометан хпДНК - хлоропластная ДНК

ЦМС - ци то плазматическая мужская фертильность ЭДТА- этилендиаминтетрахлоруксусная кислота AFLP - amplification fragments length polymorphism ВС - беккроссное поколение BYDV- вирус желтой карликовости ячменя Fi - гибрид первого поколения GISH - genomic in situ hybridization ІТМІ - international Triticeae mapping initiative Кг- гены скрещиваемости NC - ядерно-цитоплазматические

Ncc - гены ядерно-цитоплазматической совместимости

QTL - quantitative trait loci, локусы количественных признаков

RAMPO - random-amplified microsatellite polymorphism

RAPD - random amplified polymorphic DNA

Rf- гены восстановители фертильности

RFLP - restriction fragment length polymorphism DNA

Si- S3 - самоопыленные поколения после колхицинирования

SCAR - sequence characterized amplified regions

SDS - додецил сульфат Na

STS - sequence-tagged sites

ssc- гены совместимости

SSR - simple sequence repeats

SNP -single nucleotide polymorphism

Xgwm - Gatersleben Wheat Microsatellite

Эффекты ядерно-цитоплазматических взаимодействий у аллоплазматических линий пшеницы

Считается, что одним из способов создания высокоурожайных, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам форм пшеницы является использование так называемой гибридной пшеницы, то есть такого генотипа, в котором проявляется эффект гетерозиса (Неттевич, 1971). Кихара (Kihara, 1979) интродуцировал цитоплазму Ае. squarrosa в мягкую пшеницу и обнаружил влияние чужеродной цитоплазмы на раннее созревание и повышение урожайности у некоторых генотипов мягкой пшеницы. Это наблюдение позволило сделать предположение о существовании у пшеницы ядерно-цитоплазматического гетерозиса. Описано, что влияние чужеродной цитоплазмы может быть полезным для улучшения некоторых показателей продуктивности сельскохозяйственных растений. Так, обнаружено повышение урожайности зерна, индекса продуктивности и времени выколашивания в ответ на введение цитоплазмы Avena sterilis L в линии A. sativa L (Robertson, Frey, 1984). В реципрокных скрещиваниях Zea mays L по некоторым признакам продуктивности отмечены различия, которые являются следствием ядерно-цитоплазматического взаимодействия (Baynes, Brawn, 1973).

В течение нескольких десятилетий была проделана значительная работа по поиску наиболее удачных комбинаций внутривидовых, межвидовых и межродовых скрещиваний для создания перспективных генотипов гибридной пшеницы, а также по созданию эффективных систем ЦМС и анализу генетических основ ядерно-цитоплазматического взаимодействия. Так в ходе работ геномы тетраплоидных и гексаплоидных пшениц путем беккроссирования были скомбинированы с цитоплазмами более чем 30 различных видов (Panayotov, Gotsov, 1976; Ohtsuka, 1991; Maan, 1995). В результате многократного беккроссирования одного вида другим происходит замена хромосом материнской формы на хромосомы отцовской, формируются генотипы, теоретически сочетающие ядерный геном одного вида и цитоплазматический геном другого, так называемые аллоплазматические линии или ядерно-цитоплазматические (NC) гибриды (Kaul, 1988). Наибольшее количество аллоплазматических линий было получено с использованием различных видов пшениц, эгилопсов и пырея, родственных мягкой пшенице (Panayotov, 1980; Tsunewaki, 1980). Именно благодаря созданию множества различных аллоплазматических линий стало возможным целенаправленно изучать характер взаимодействия ядерного и цитоплазматического геномов в экспрессии различных признаков гибридных растений.

Для изучения разнообразия цитоплазматического генома и ядерно-цитоплазматических взаимоотношений применялись, главным образом, два подхода: а) фенотипическая характеристика NC гибридов с данным ядерным геномом и различными чужеродными цитоплазматическими геномами, б) анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов хлоропластных и митохондриальных ДНК у NC гибридов. Эти работы основывались на предположении об однородительском, материнском, наследовании цитоплазмы и отсутствии наследственных изменений в NC гибридах. Цитоплазматические геномы 47 образцов рода Triticum и Aegiiops были классифицированы в 15 основных типов плазмона и 7 дополнительных подтипов (Tsunewaki et al., 1983, 2002). В работах Кихары {Kihara, 1979), Панайотова и Гоцова (Panayotov, Gotsov, 1976) были отмечены следующие характерные для аллоплазматических линий явления: 1. Чужеродные цитоплазмы индуцировали проявление «новых» фенотипов пшеницы в результате ядерно-цитоплазматического взаимодействия. 2. Фенотипические эффекты чужеродной цитоплазмы сохраняются в поколениях. 3. Существует широкое генетическое разнообразие среди типов цитоплазм Triticinae. Первую серию аллоплазматических линий пшеницы получил в 1951 г. Кихара (Kihara, 1951), используя ядро мягкой пшеницы и цитоплазму дикого злака Aegiiops ovata. В последующем были получены замещенные линии пшеницы с ядром Т. aestivum и Т. durum и органельными геномами различных видов Aegiiops (Fukasawa, 1959; Panayotov, Gotsov, 1976; Tsunewaki et al., 1980). Коллекция аллоплазматических линий, созданная в Японии, в настоящее время включает линии на основе 12 ядерных генотипов гексаплоидной пшеницы (2n=42; AABBDD), имеющие цитоплазматический геном 8 различных видов пшеницы (10 источников) и 24 видов Aegiiops (36 источников) - всего 552 комбинации (Tsunewaki et al., 2002).

Отмечено, что в качестве доноров ядерного генома более предпочтительными оказались диплоидные и тетраплоидные виды, так как на основе гексаплоидных видов эффекты плазмонов экспрессируются хуже (Маап 1992). Оказалось, что эффекты многих аллоплазмонов настолько неблагоприятны, что создание и поддержание аллоплазматических линий даже при использовании тетраплоидных видов затруднительно. Аллоплазматические линии мягкой пшеницы имеют различные фенотипические проявления, которые индуцируются чужеродным плазмоном. Показано, что цитоплазма Ае. caudata отрицательно влияет на ряд признаков мягкой пшеницы, повышает процент беззародышевых семян, число гаплоидов и близнецовых проростков, а у твердых пшениц снижает и женскую фертильность. Также цитоплазма Ае. caudata оказывает неблагоприятное влияние на рост, кущение и содержаение сухого вещества у некоторых сортов мягкой пшеницы (Kihara, Tsunewaki, 1964). Действие цитоплазмы Ае. ovata сказывалось на длине вегетационного периода, росте и кущении ядерно-цитоплазматических гибридов, а также формировании их хлорофильного аппарата (Fukasawa, 1959). Интересно, что цитоплазма Ае. squarrosa не оказывала подавляющего эффекта на рост мягкой пшеницы. Ядерно-цитоплазматические гибриды на цитоплазме Ае. squarrosa имели фертильную пыльцу, мощное развитие и во многих случаях были более раннеспелыми по сравнению с контролем (Kihara, 1979). В работе Панайотова описаны аллоплазматические линии пшеницы, полученные на основе двух сортов мягкой пшеницы и 129 цитоплазмонов различных видов и подвидов Triticum, Aegilops, Secale, Адгородоп и Haynaldia (Panayotov, 1983). 37 плазмонов оказывали стерилизующий эффект на пыльцу пшеницы, у некоторых фертильных аллоплазматических линий наблюдался эффект ядерно-цитоплазматического гетерозиса (Panayotov, 1983). Часть плазмонов вызывала нарушения роста и развития растений, причем степень проявления неблагоприятного воздействия чужеродной цитоплазмы зависела от генотипа донора ядра. Похожий результат описан и в работе по изучению беккроссных потомков гибридов Адгоругоп с мягкой пшеницей, в которой сообщалось, что нарушение ядерно-цитоплазматического взаимодействия приводит к понижению жизнеспособности и низкой фертильности растений (Sharma, Gill, 1983).

Изменения во фракции низкокопийных некодирующих последовательностей

Наиболее очевидное генетическое последствие аллополиплоидии -дупликация генов (Wendel, 2000). В этом случае дуплицированные (гомеологичные) копии отдельных хромосом, сегментов хромосом, или генов являются привнесенными из разных донорских таксонов во время формирования аллополиплоида. С дуплицированными генами могут происходить различные функционально-генетические изменения, которые заключаются, во-первых, в приобретении геном новой функции, во-вторых, в разрушении путем мутаций и появлении псевдогенов, однако часто обе копии гена сохраняют свои функции.

Для изучения изменения генома аллополиплоидов были изолированы низкокопийные, предположительно некодирующие, последовательности из геномной библиотеки плеча хромосомы 5BL мягкой пшеницы (Liu et al., 1997) и геномной библиотеки мягкой пшеницы (Sharp et al., 1989). Секвенированием показано, что эти последовательности содержат большое число стоп-кодонов и имеют относительно короткие открытые рамки считывания, поэтому, предположительно, являются некодирующими. В работах использовали те последовательности, которые присутствовали во всех геномах диплоидных видов Aegtlops и Triticum, но являлись хромосомо-специфичными и геномо-специфичными на полиплоидном уровне. Отсутствие этих последовательностей в одном из геномов тетраплоидной пшеницы и в двух геномах гексаплоидной пшеницы указывает на их специфичную элиминацию из этих геномов на полиплоидном уровне (Feldman et al.,1997).

Например, методом RFLP были проанализированы аллополиплоиды с третьего (S3) (S - поколение после колхицинирования) по шестое (Se) поколение и растения родительских линий (Feldman et al., 1997; Liu et al., 1998). При этом было показано, что у вновь синтезированных аллополиплоидов ТгШсит и Aegifops наблюдалась элиминация определенных последовательностей, И у природных, и у вновь синтезированных растений наблюдалась схожая схема элиминации, что указывает на не случайность этого события (Feldman et al., 1997). У аллополиплоидов присутствие определенной последовательности в одном геноме может влиять на ее элиминацию из других геномов, при этом происходит элиминация данной последовательности из одного генома и сохранение в другом (Liu et al., 1998). Также было показано, что элиминация какой-либо из последовательностей не связана с потерей плеча или сегмента хромосомы, и что обнаруженные геномные изменения в алло полиплоидах не вызваны изменениями в метилировании ДНК (Feldman et al., 1997).

Однако, сравнивая аллополиплоиды с родительскими линиями, нельзя было со всей определенностью утверждать, что наблюдаемые изменения обусловлены гибридизацией или аллополиплоидизацией, а не полиморфизмом внутри родительских линий. Поэтому была проведена работа (Ozkan et а!.. 2001), где сравнивали гибриды Fi и аллополиплоиды с первого (Si) по третье поколение (S3), с родительскими растениями. Результаты этой работы показали, что геномные изменения обусловлены именно аллополиплоидизацией, и также установить скорость и момент элиминации последовательностей.

Элиминация последовательностей начинается раньше у тех аллополиплоидов, чей геномный состав аналогичен таковому природных полиплоидов, по сравнению с аллополиплоидами, не имеющими природных аналогов. Кроме того, было показано, что направление и время элиминации определяется типом и происхождением элиминируемой последовательности. Например, элиминация геном-специфичных последовательностей начинается в Fi и завершается в S2 или S3, тогда как элиминация хромосом-специфичных последовательностей начинается в первом поколении аллополиплоидов (Si) и завершается во втором (S2) или третьем (S3). Элиминация последовательностей не зависит от генотипа родительских растений (наблюдаемые геномные изменения у аллополиплоидов, полученных при гибридизации разных линий одних видов, оказались аналогичными), ни от их цитоплазмы. Было сделано заключение, что элиминация последовательностей не зависит от уровня плоидности (Ozkan et а)., 2001), что вступает в противоречие с предыдущими данными (Liu et al., 1998), полученными при изучении гекса-, окто- и декаплоидов, которые показали, что последовательности элиминировали из генома родителя с более низкой степенью плоидности.

Геномные изменения при образовании гибридов Fi и аллополиплоидов были выявлены при скрининге большого числа локусов с использованием метода AFLP и при оценке степени метилирования цитозина (Snaked et al., 2001). Выявлено, что элиминация последовательностей - явление, которое действует на большие фракции генома и возникает на ранних стадиях аллополиплоидизации. Предложено несколько механизмов элиминации последовательностей (Shaked eta!., 2001): 1) генная конверсия между гомеоаллелями; 2) вырезание последовательности и последующая потеря через такие механизмы, как вырезание транспозонами или сайт-специфическая рекомбинация; 3) кроссинговер между прямыми повторами, которые фланкируют элиминируемую последовательность, и последующая потеря вырезаемого кольца. Одним из примеров повторяющихся последовательностей являются повторы генов рибосомальных РНК (рРНК). У 5S рДНК и 45S рДНК, кодирующие районы повторяющихся единиц консервативны, при этом нетранскрибируемые спейсерные районы очень полиморфны и по длине, и по последовательности нуклеотидов внутри вида (Gerlach, Dyer, 1980; Dvorak, Appels, 1982). Анализ разных сортов Т. aestivum и индивидуальных растений Т. dicoccoides показал, что популяция рДНК внутри одного растения однородна. Быстрая фиксация отдельного варианта из тысячи или более единиц рДНК может указывать на необычайно эффективный механизм типа конверсии (Appels, Dvorak, 1982).

Условия ПЦР, RAPD-анализ и кроссгибридизация RAPD фрагментов, использованные в данной работе

Для RAPD-анализа (Williams et al., ) использован набор из праймеров с произвольной последовательностью длиной 10-11 пн с GC составом от 36 до 72%, синтезированные В.Ф. Кобзевым в ИЦиГ СО РАН (Приложение, таблица 1). С каждым праймером эксперимент повторяли 2-4 раза. Последовательности случайных праймеров разрабатывались на основе известных последовательностей ДНК мягкой пшеницы, также были использованы праймеры, которые применялись для изучения полиморфизма сортов мягкой пшеницы (Myburg et al., ). Для выявления митохондриальных последовательностей применялись специфические праймеры к различным районам митохондриального генома пшеницы (Приложение, табл. 2). ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 50нг ДНК-матрицы, 67 мМ трис-HCI (рН 8.8), 1.8 мМ MgCI2, 18 мМ (NH4)2S04; 0.1% Tween 20, 0.01 М 2-меркаптоэтанол, по 0.2 мМ каждого дНТФ, 0.5мкМ случайного праймера (для RAPD анализа) или по 0.25 мкМ прямого и обратного специфических праймеров, 1 ед. ДНК-полимеразы Taq. Реакцию проводили в следующих условиях: денатурация -1 мин/та при 94 С; отжиг - 2 минуты при 37 С (для ПЦР со случайным праймером) или при 55 С (для ПЦР со специфическими праймерами); полимеризация - 2 минуты при 72 С; число циклов - 35. ПЦР осуществляли в Perkin Elmer Cetus thermocycler (USA). Эксперимент по кросс-гибридизации проводился в двух модификациях: 1) выделенный из агарозного геля фрагмент аллоплазматической рекомбинантной линии, соответствующий фрагменту ячменя, нарабатывался с соответствующим праймером и использовался в качестве зонда для гибридизации; 2) полный спектр RAPD-фрагментов ячменя применялся для гибридизации. Второй вариант оказался более предпочтительным, т.к. ПЦР с очищенной ДНК в большинстве случаев приводила к наработке нескольких фрагментов из-за примеси фрагментов другой длины, что значительно усложняло поведение анализа.

Выделение ПЦР-фрагментов из агарозного геля осуществляли с помощью набора реактивов «Wizard» фирмы «Promega». Выделенные из агарозного геля ПЦР фрагменты, соответствующие фрагментам ячменя, использовались в качестве зондов для гибридизации с соответствующими RAPD-спектрами. Для кросс-гибридизации разделенные в 2% агарозном геле ПЦР-фрагменты переносили на нейлоновую мембрану (HYBOND N+ «Amersham»). Из реакционной смеси после ПЦР отбирали 1 мкл для мечения или использовали выделенные из агарозного геля RAPD фрагменты в количестве 50 мкг. Включение (cc-P32)dATP (Amersham) осуществляли с использованием статистического набора праймеров (Feinberg, Vogelstein, ). Бпот-гибридизацию проводили согласно стандартному протоколу «Amersham» ДНК образцов аллоплазматических линий и родительских видов обрабатывали эндонуклеазами рестрикции в соответствии с инструкциями фирм -поставщиков рестриктаз ("Pharmacia", "Promega"). Электрофоретический анализ продуктов рестрикции проводили в 0, 8% агарозном геле, как описано в главе 2.5.

Разделение продуктов ПЦР со случайными или специфическими праймерами проводили в 2% агарозном геле или 0,8% агарозном геле при разделении продуктов рестрикции. Гель готовили на ТАЕ-буфере (40 мМ Трис-НСІ рН 80, 20 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА) с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 0.01 металл. Наносили в карманы геля по 10 мкл реакционной смеси с добавлением 5 % глицерина, 0.05% бромфенолового синего и 0.05% ксиленцианопа. В качестве маркера длины фрагментов ДНК использовали Psfl-гидролизат ДНК фага Я. Электрофорез вели при напряжении 3-7 вольт/см в течение 2-3 часов, затем фотографировали в УФ-свете.

Для проведения RAMPO-анализа продукты ПЦР, амплифицированные с применением одного из 49 RAPD-праймеров (Приложение, таблица 1), после электр офоретического разделения в 2% агарозном геле переносили на нейлоновую мембрану HYBOND N+ «Amersham». Далее проводили гибридизацию согласно стандартному протоколу «Amersham» с зондом длиной около пн, содержащим меченые (a-P32)dATP (Amersham) повторы двух оснований GA.CT или GT.CA. Каждый RAPD-спектр анализировали с использованием двух зондов, поочередно. После гибридизации фильтры заворачивали в полиэтиленовую пленку и экспонировали с рентгеновской пленкой "Кодак" в течение 24-72 часов при комнатной температуре. Фрагмент амплификации ДНК линии 16(1)F3, полученный в ПЦР с праймером (5 -CAACTAGACGG-3 ), был выделен из агарозного геля с помощью набора реактивов «Wizard» фирмы «Promega». Клонирование фрагмента осуществляли с использованием набора реактивов "ТА cloning kit" фирмы "Invitrogen".

Секвенирование вставки рекомбинантного плазмидного клона проводили по методу Сенгера (Sanger et al., } в автоматическом лазерном флюоресцентном секвенаторе (ALF sequencer, Pharmacia), используя праймеры М 13 (прямой 5 -GTAAAACGACGGCCAGT-3\ обратный 5 - CAGGAAACAGCTATGAC- 3 ). Анализ первичной структуры проводили с использованием компьютерной программы BLASTN (Altschul et al., ). К клонированной последовательности с использованием программы «OLIGO» (W. Rychlik, USA) были подобраны праймеры; прямой 5 -CTGCCGCCTAGCACGTAC-3\ обратный 5 - TTTGCGCATAGTTACGCC-3 . Фрагменты ПЦР-амплификации ДНК линии J1-79(10)F3, полученные с праймерами R , R и R (Приложение, табл. 1), специфически выявляющие генетический материал ячменя, были выделены из агарозного геля и клонированы с использованием наборов реактивов (QIAquick, QIAGEN PCR Cloning Kit; QIAGEN). Нуклеотидные последовательности вставки рекомбинантного плазмидного клона определяли на автоматическом лазерном флюоресцентном секвенаторе ABI Prism Genetic analyzer, используя набор BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Prkin Elmer, США) согласно инструкциям производителя и праймеры М13 (прямой 5 -GTAAAACGACGGCCAGT-3\ обратный 5 - CAGGAAACAGCTATGAC-3 ). Первичную структуру последовательностей ДНК анализировали с использованием компьютерных программ BLASTN (Altschul et al., ), REPFIND (Betley et al., ), DNAmfold (Zuker, ), NNPP (Reese, ). 2.8. Саузерн-гибридизация с фрагментом tMeM8S-5S мтДНК 4 мкг геномной ДНК Н, vulgare (сорт Неполегающий), трех сортов Т. aestivum (Саратовская 29, Пиротрикс 28, Мироновская 10) и JI-79(10)F3, обработанной эндонуклеазами рестрикции Нае\\\, Hind\\\, BamHl (GibcoBRL), после электрофоретического разделения в 0,8% агарозном геле переносили на нейлоновую мембрану (HYBOND N+, Amersham). Для мечения использовали 50 нг очищенных с использованием набора реактивов (QIAquick) ПЦР-фрагментов tMet-18S-5S мтДНК. Качество зонда проверяли секвенированием, которое показало % гомологию с последовательностью, описанной в работе (Coulthart et al., ). Включение (a-P32)dATP (Amersham) проводили со специфическими праймерами к последовательности tMet-18S-5S. Саузерн-гибридизацию делали согласно стандартному протоколу «Amersham».

Анализ аллоплазматических линий мягкой пшеницы с различным проявлением признака фертильности методом RAPD

Так как метод RAMPO позволил выделить фрагменты генома родительских сортов Т. aestivum в геноме аллоплазматических рекомбинантных линий, это позволяет рекомендовать его для молекулярно-генетических исследований, связанных с идентификацией различных сортов мягкой пшеницы. На основании результатов, представленных в этой части работы, можно заключить, что при использовании метода RAMPO выявляются значительные различия между спектрами фрагментов ДНК ячменя (Н. vulgare и Н. geniculatum) и мягкой пшеницы Г, aestivum, а также показан низкий сортовой полиморфизм мягкой пшеницы. Было обнаружено, что процесс формирования аллоплазматических рекомбинантных линий сопровождался перестройкой их генома, которая характеризуется изменением RAMPO-спектров по сравнению с родительскими сортами мягкой пшеницы.

Полученные данные приводят к заключению, что при использовании метода RAMPO фрагменты Н. vulgare в геномах аллоплазматических рекомбинантных линий Л-16(1)Р3, Л-17(1)Р3, Л-79(10)Рз не обнаруживаются. При анализе аллоплазматической дополненной линии Л-9Р7 (2n=43+t) выявляется интрогрессия генетического материала ячменя Н. geniculatum во вновь формирующийся геном аллоплазматической линии. Также при использовании метода RAMPO показано, что в спектрах аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы определяются фрагменты гибридизации, которые маркируют сорта пшеницы Т. aestivum, использованные при получении линий. Анализ аллоплазматических линий мягкой пшеницы с различным проявлением признака фертильности методом RAPO В предыдущей части исследования выявлено, что геном нестабильной по проявлению фертильности аллоплазматической рекомбинантной линии мягкой пшеницы Л-79(10)Рз, в отличие от стабильных по проявлению этого признака линий Л-16(1)Рз и Л-17(1)Рз, характеризуется присутствием фрагментов генома Н. vulgare. В данном разделе работы для изучения особенностей генома в зависимости от проявления фертильности дополнительно введены новые линии. Среди аллоплазматических рекомбинантных линий, полученных на основе беккроссных потомков ячменно-пшеничных гибридов Н. vulgare (2n=14) х Т. aestivum (2п=42) двух комбинаций: (ячмень сорта Неполегающий х пшеница сорта Саратовская 29) и (ячмень формы я-319 х пшеница сорта Саратовская 29) были отобраны линии, которые различаются по признаку самофертильности (табл. 2). Результаты RAPD-анализа аллоплазматических линий мягкой пшеницы, характеризующихся различным проявлением признака фертильности, с использованием RAPD-праймеров, выявляющих присутствие генома культурного ячменя Н. vulgare у линии J1-79(10)F3.

В данную часть работы включены потомки линии Jl-79(10)F3t стабильная по проявлению фертильности, хорошо озерненная линия Л-79(10)(3) F6; линия Л-79(10)(2)Fs, все образцы которой представлены растениями с проявлением мужской стерильности и низкой озеренностью; линия Л-79(10)(2)Рб, полиморфная по проявлению признаков фертильности. Так, образец 1 линии Л-79(10)(2)Р6 был представлен мощными, высоко озерненными растениями, образец 2 — высокорослыми, кустистыми, но слабо озерненными растениями, а образцы 3 и 4 - полностью стерильными растениями. Кроме того, в этом разделе работы изучены и линии другого происхождения, Л-14(1)Р3, Л-54(1)Рз, все изученные образцы которых представлены растениями с низкой озерненностью (табл. 2).

Для анализа генома аллоплазматических линий были использованы три RAPD-праймера, которые выявляли присутствие фрагментов генома культурного ячменя в геноме нестабильной по проявлению фертильности аллоплазматической линии Л-79(10)Р3.

Результаты проведенного анализа показали, что в геномах всех изученных образцов, за исключением линии Л-79(10)(3)Рб и образца 1 линии Л-79(10)(2)Р6, обнаруживаются фрагменты генома ячменя такой же длины, что и у линии Л-79(10)F3 (табл. 6). Следует отметить, что Л-79(10)(3)Р6 и образец 1 линии Л-79(10)(2)Fe характеризуются восстановленной фертильностью (табл. 2).

Итак, по результатам, полученным в данном разделе исследования, можно заключить, что в геномах всех изученных образцов аллоплазматических линий, характеризующихся нестабильностью по проявлению фертильности, обнаруживаются RAPD-фрагменты генома Н. vulgare такой же длины, что и у ранее изученной нестабильной по проявлению этого признака линии Л-79(10)Рз. У образцов аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы с восстановленной фертильностью фрагменты генома Н. vulgare не выявлены. Из RAPD-спектров линии Л-79(10)Рз были клонированы фрагменты ДНК, характерные для генома ячменя, определены их нукпеотидные последовательности, которые помещены в базу даннных (GenBank). В таблице 7 приведены результаты анализа их первичных последовательностей с использованием компьютерных программ (Часть 2.8. Раздел "Материалы и методы"). Первичные последовательности клонированных фрагментов Результаты анализа с использованием компьютерных программ первичных последовательностей RAPD-фрагментов, выделенных из генома аллоплазматической линии J1-79(10)F3- размещены в Приложении. Все три изученные последовательности могут образовывать сложные вторичные структуры и имеют различные регуляторные элементы (сигналы начала трансляции, ТАТА-боксы, сайты полиаденилирования, репрессоры транскрипции, промоторы), однако ни одна из них не является кодирующей. Интересно отметить, что в последовательностях НТЗ и НТ4 выявлены микросателлитные мотивы. Для последовательности НТ5 не найдено гомологии с последовательностями, находящимися в базах данных (табл. 7). Что касается двух других RAPD-фрагментов, НТЗ и НТ4, то оказалось, что они имеют гомологию с последовательностями из митохондриального генома риса, а небольшой участок последовательности НТЗ гомологичен встроенному в митохондриальный геном кукурузы ЦМС-элементу S-1 (Altschul et al., 1997). Консервативность последовательностей растительного митохондриального генома отмечается многими исследованиями (Lonsdale et al., 1988; Hanson, Folkerts, 1992; Lonsdale, Grienenberger, 1992), что дает основания отнести последовательности НТЗ и НТ4 к мтДНК ячменя. Что касается последовательности НТ5, то ее также можно считать митохондриальной по результатам RAPD-анализа аллоплазматических линий, которые аналогичны для всех трех последовательностей (НТЗ, НТ4, НТ5). О митохондриальном происхождении последовательностей также свидетельствует их низкий GC состав (Vedel F., Queiter, 1974; Notsu et al., 2002).

Похожие диссертации на Молекулярно-генетический анализ аллоплазматических рекомбинантных линий (Hordeum vulgare)-Triticum aestivum с разным проявлением фертильности