Введение к работе
Актуальность проблемы. Принципы структурно-функциональной организации интерфазных хромосом до сих пор во многом не понятны. Их изучение является одной из главных задач современной биологии. Политенные хромосомы двукрылых, которые рассматриваются в качестве модели интерфазной хромосомы, открывают большие возможности в этом направлении. Большие размеры хромосом и относительно высокая специфичность дискового рисунка позволяют легко идентифицировать отдельные хромосомы и их районы. Исследования на политенных хромосомах позволили достичь значительного прогресса в поншлании генетической организации отдельных хромомеров (дисков) и особенностей их функционирования. Однако до сих пор почти ничего не известно о функциях межхромомеров (междисков). Роль междисков может быть определена в результате анализа их молекулярной организации. Однако малые размеры междисков, низкое содержание ДНК в них и отсутствие адекватных методов не позволяют точно соотнести между собой молекулярные и цитологические данные для этих районов.
Метод Р-трансформации генома дрозофилы искусственно созданными фрагментами ДНК с известными молекулярно-генетическими характеристиками (Spradling, Rubin, 1982; Rubin, Spradling, 1983) В сочетании с электронно- микроскопическим (ЭМ)анализом трансформированных районов хромосом открывает новые возможности для решения вопросов структурно-функциональной организации политенных хромосом. С использованием этого подхода была показана принципиальная возможность обнаружения новых морфологических структур, образованных материалом Р-традспозоков, и изучения их стуктурно- функциональных особенностей в составе хромосом (Semeshin et al., 1986). Учитывая эти факты', проблему точной привязки молекулярных и цитологических структур в районах междисков можно было бы решить следующим образом. С помощью ЭМ картирования трансформированных районов хромосом, выявить те из них, в которых встройка транспозона произошла в район междиска. Затем, используя молекулярные методы, клонировать ДНК междиска, прилегающую к встроенному фрагменту, и исследовать ее молекулярно-, генетическую организацию.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является клонирование и молекулярно-генетический анализ ДНК из района междиска, в связи с этим были поставлены следующие конкретные за-
дачи исследования:
-
Провести электронно-микроскопический (ЭМ) анализ трансформированных районов политенных хромосом и определить в них локализацию встроек Р-транспозонов.
-
Получить библиотеку геномных фрагментов ДНК одной из трансформированных линий мух, содержащей встройку транспозона в районе междиска.
-
Провести скрининг этой библиотеки с помощью меченых фрагментов ДНК транспозона для получения клонов, содержащих материал транспозона и прилежащего к нему междиска;
-
Определить нуклеотиднус последовательность ДНК из района междиска и провести ее молекулярно- генетический анализ. Научная новизна. В настоящей работе впервые проведенно детальное ЭМ картирование 10 районов политенных хромосом слюнных желез ГОМОЗИГОТНЫХ ЛИНИЙ Drosophila melanogaster, содержащих Р-транспозоны с определенными молекулярно-генетическими характеристиками. На основании результатов этого картирования было показано преимущественное встраивание транспозонов в районы междисков и предложен новый подход к клонированию ДНК из районов междисков. Впервые клонирована и частично охарактеризована на молекулярно-генетическом уровне ДНК из района мекдиска 61С7/С8 хромосомы 3.
Практическая ценность. На основании результатов, полученных в данной" работе, предложен новый подход к клонированию ДНК из районов междисков, что имеет существенное значение для дальнейшего анализа структурно- функциональной организации интерфазных хромосом и эукариотического генома в целом. Апробация работы. Основные результаты данного исследования докладывались на 6-ом Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), 6-ом Всесоюзном совещании по генетике дрозофилы (Одесса, 1939), 10-м Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 1990), 7-м Международном совещании "Молекулярная биология и биология развития дрозофилы" (Крит, Греция, 1990), 7-м Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом" (Пушино, 1991).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в пяти научных публикациях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, которые содержат обзор литературы, описание материалов и методов, результаты и обсуждение, а также выводов и списка цитируемой литературы. Общий объем работы 142 страницы, 6 таблиц и 24 рисунка.