Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 9
1.1 Пшеница как важнейшая сельскохозяйственная культура 9
1.2 Предуборочное прорастание зерна как фактор, влияющий на качество урожая пшеницы 1.2.1 Покой семян как стратегия выживания растений 10
1.2.2 Предуборочное прорастание 12
1.2.3 Механизм прорастания 14
1.2.4 Оценка на устойчивость к предуборочному прорастанию 15
1.2.5 Генетические аспекты устойчивости к предуборочному прорастанию 17
1.3 Ген Viviparous-1 20
1.3.1 Ген Viviparous-1 как часть эмбриогенеза 20
1.3.2 Ген Viviparous-1 у пшеницы 22
1.3.3 Функционирование генов Viviparous-1 23
1.4 Филогения пшеницы и пыреев 27
1.4.1 Геномный состав пшеницы 28
1.4.2 Генетические ресурсы для улучшения пшеницы 29
1.4.3 Таксономия трибы пшеницевых 29
1.4.4 Филогенетика видов пырея 32
1.5 Биологическое описание дикорастущих сородичей пшеницы 35
1.5.1 Thinopyrum intermedium 35
1.5.2 Thinopyrum ponticum 38
1.6 Пшенично пырейные гибриды 39
1.6.1 История пшенично-пырейных гибридов 39
1.6.2 ППГ как ценный источник морфологического разнообразия 43
1.6.3 ППГ как ценный источник генетического разнообразия 44 1.6.3.1 ППГ как источник хозяйственно-ценных признаков 44
1.6.3.2 Генетический полиморфизм ППГ 46
1.7 Молекулярные маркеры в селекции пшеницы 47
1.7.1 Определение понятия «молекулярные маркеры» 47
1.7.2 Создание молекулярных маркеров. 48
1.7.3 Применение молекулярных маркеров в селекции растений 49
1.7.4 Классификация молекулярно-генетических маркеров 49
1.7.5 Молекулярные маркеры гена Viviparous-1 мягкой пшеницы 51
ГЛАВА 2 Материалы и методы 53
2.1 Растительный материал 53
2.2 Методы исследования
2.2.1 Выделение ДНК из растительного материала 54
2.2.2 ПЦР-анализ 55
2.2.3 Секвенирование и анализ частичных последовательностей гена Vp-1 58
2.2.4 Оценка коллекции ППГ на устойчивость к предуборочному прорастанию 60
2.2.5 Статистический анализ данных. 61
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение 61
3.1 Секвенирование частичных последовательностей гена Vp-1 у
дикорастущих сородичей пшеницы 63
3.1.1 Клонирование гаплотипов гена Vp-1 дикорастущих сородичей пшеницы 66
3.1.2 Сравнительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей дикорастущих видов
3.1.2.1 «Часть I» экзон 1 гена Vp-1 68
3.1.2.2 «Часть II» 1-3 экзоны, 1-3 интроны гена Vp-1 75
3.1.2.3 «Часть III» 3-5 экзоны, 3-5 интроны гена Vp-1 82
3.1.2.4 «Часть IV» 5-6 экзоны, 5-6 интроны гена Vp-1 90
3.2 Гипотетический полноразмерный ген Vp-1 дикорастущих сородичей пшеницы 97
3.3 Филогенетический анализ гипотетических полноразмерных последовательностей гена Vp-1 дикорастущих сородичей пшеницы 102
3.4 Разработка молекулярного маркера, позволяющего отличать ген Vp-1 пырейного происхождения от генов Vp-1 мягкой пшеницы
3.4.1 Молекулярный CAPS-маркер Vp1BB4-HaeIII 109
3.4.2 Молекулярный маркер Vivip 112
3.5 Анализ полиморфизма коллекции пшенично пырейных гибридов 116
3.5.1 Оценка коллекции ППГ на показатели покоя семян 116
3.6 Анализ влияния гена ряда генотипических и морфологических признаков на устойчивость к предуборочному прорастанию у ППГ 124
3.6.1 Анализ влияния гена Viviparous-1 пырейного происхождения на устойчивость к предуборочному прорастанию у ППГ 125
3.6.2 Анализ влияния гена Viviparous-1 пшеничного происхождения на устойчивость к предуборочному прорастанию у ППГ
128
3.6.3 Анализ влияния окраски зерна на устойчивость к предуборочному прорастанию у ППГ 131
3.6.4 Анализ взаимосвязи между устойчивостью к предуборочному прорастанию, аллельным состоянием гена Vp-1 пырейного происхождения и интенсивностью окраски зерна у ППГ 134
Заключение 138
Выводы 140
Список литературы 141
- Предуборочное прорастание
- Выделение ДНК из растительного материала
- Клонирование гаплотипов гена Vp-1 дикорастущих сородичей пшеницы
- Оценка коллекции ППГ на показатели покоя семян
Введение к работе
Актуальность темы. Мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) является важной сельскохозяйственной культурой, занимающей ведущие позиции в мировом производстве зерна. В связи с ростом населения Земли спрос на пшеницу продолжает расти. Однако стабильное получение урожаев сталкивается с рядом проблем. Прорастание на корню для пшеницы является одним из препятствий для производства зерна, так как оно серьезно ухудшает качество конечного продукта – муки. В частности, при прорастании семени синтез -амилазы приводит к распаду крахмала и производству хлеба с низким уровнем объема и липкой структурой мякиша (Chang, 2010). Единственным способом решения данной проблемы является создание устойчивых к прорастанию на корню сортов.
Предуборочное прорастание происходит вследствие нарушения периода покоя. Ген Viviparous-1 (Vp-1) является одним из важных регуляторов позднего эмбриогенеза у пшеницы и других злаковых культур. Изучение генов-ортологов Vp-1 различных культур показало, что они кодируют факторы транскрипции, характеризующиеся высоким уровнем экспрессии в развивающихся эмбрионах семян. Ген выполняет две различных функции: первая – обеспечение созревания зародыша, вторая – регуляция перехода семени в покой и ингибирование прорастания.
Анализ структуры и функционирования гена Vp-1 у различных злаков
может дать новые сведения о механизмах взаимодействия генетических систем
в растительном организме, а также понять принципы регуляции толерантности
к прорастанию на корню. Все это в целом позволит разработать новые подходы
к борьбе с прорастанием зерновых культур на корню, в том числе с
использованием направленной интрогрессии методами отдаленной
гибридизации.
Одним из перспективных методов интрогрессии чужеродных генов в
геном мягкой пшеницы является использование в качестве «селекционного
мостика» октоплоидных пшенично-пырейных гибридов (ППГ). Кроме того, они
являются удобным модельным объектом для предварительного изучения
проявления пырейных генов в присутствии полного генома пшеницы. Также
ППГ имеют большой потенциал и как самостоятельная культура. Они обладают
такими хозяйственно-ценными признаками, как многолетность,
морозостойкость, толерантность к многим абиотическим факторам,
устойчивость к болезням и вредителям (Hayes et al., 2012; Larkin and Newell, 2014). В последние годы вновь возрос интерес к ППГ как к самостоятельной сельскохозяйственной многолетней культуре, способной снизить нагрузку на окружающую среду, уменьшить затраты на возделывание и давать стабильные
урожаи на маргинальных почвах (Lloyd, 2015). До настоящего времени не было сообщений об уровне толерантности к прорастанию на корню у пшенично-пырейных гибридов.
Цель нашего исследования - изучение генов Viviparous-1 (Vp-l) дикорастущих сородичей пшеницы.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Клонирование и секвенирование гаплотипов гена Vp-І у видов Thinopyrum intermedium, Thinopyrum pontwum, Thinopyrum bessarabwum, Pseudoroegnena spicata и Dasypyrum villosum;
Биоинформационный и филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей генов Vp-1;
Создание молекулярного маркера на гены Vp-І пырейного происхождения;
Изучение полиморфизма коллекции пшенично-пырейных гибридов по признаку толерантности к предуборочному прорастанию;
Анализ полиморфизма коллекции пшенично-пырейных гибридов по генотипическим и морфологическим признакам, ассоциированным с толерантностью к предуборочному прорастанию.
Научная новизна. Впервые получены нуклеотидные последовательности различных гаплотипов гена Vp-І дикорастущих сородичей пшеницы: Th. intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum, Ps. spicata и D. villosum.
На основе различий в полученных нуклеотидных последовательностях созданы два молекулярных маркера, позволяющие идентифицировать и выявить различные аллельные варианты генов Vp-І пырейного происхождения в геномном окружении пшеницы.
Впервые изучен полиморфизм уникальной коллекции октоплоидных пшенично-пырейных гибридов (ППГ) по ряду генотипических и морфологических признаков, оказывающих влияние на устойчивость к предуборочному прорастанию. Методами ассоциативной генетики впервые показано влияние гена Vp-І пырейного происхождения, выявляемого с помощью разработанных нами молекулярных маркеров, на устойчивость к предуборочному прорастанию.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты, полученные в работе, имеют теоретическое значение для изучения полиморфизма, функционирования и эволюции генов злаков, отвечающих за покой семени,.
Созданные молекулярные маркеры на гены Vp-І пырейного происхождения могут быть использованы в маркер-опосредованной селекции.
Полученные результаты по оценке коллекции пшенично-пырейных гибридов могут служить основанием для планирования селекционной работы (создание модели сорта, подбор пар для скрещивания) по мягкой пшенице и ППГ.
Методология и методы диссертационного исследования.
Диссертационная работа выполнена с использованием современных методов молекулярной генетики на современном оборудовании. Подробно методология и методы исследования отражены в разделе «Материалы и методы».
Положения, выносимые на защиту.
-
У дикорастущих сородичей пшеницы наиболее консервативной частью гена Vp-1 является область функционального домена В3.
-
Созданные молекулярные маркеры выявляют различные аллельные варианты генов Vp-1 пырейного происхождения.
-
Коллекция пшенично-пырейных гибридов обладает полиморфизмом по устойчивости к предуборочному прорастанию, морфологическим признакам и аллельному составу генов Vp-1 пырейного происхождения.
-
Гены Vp-1 пырейного происхождения, выявляемые с помощью созданных молекулярных маркеров, в присутствие генома мягкой пшеницы, оказывают влияние на устойчивость к предуборочному прорастанию.
Апробация работы. Результаты проведенных исследований были доложены на 4 конференциях: на XIII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2013), на научной конференция молодых ученых и специалистов, посвященной 170-летию со дня рождения К.А. Тимирязева (Москва, 2013), на научной конференции «Современные проблемы биохимии и биотехнологии» (Уфа, 2013), на Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной созданию объединенного аграрного вуза в Москве (Москва, 2014).
Личный вклад автора. Диссертационная работа является результатом исследований, проведенных с непосредственным участием автора на всех этапах: разработка программы исследований, планирование экспериментов, проведение оптимизации и разработка методов, клонирование и секвенирование фрагментов генов, оценка коллекции пшенично-пырейных гибридов на полиморфизм по морфологическим признакам, оценка на предуборочное прорастание и молекулярно-генетическая оценка коллекции, статистическая обработка полученных данных.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ общим объемом 1,94 п.л., в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, материала и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, а также приложения. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 36 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 239 источников, из которых 215 на иностранном языке.
Предуборочное прорастание
Предуборочное прорастание – это процесс прорастания зерновок в колосе непосредственно перед уборкой урожая (Groos et al., 2002). Предуборочным прорастанием считается прорастание на корню именно физиологически спелых семян (Derera, 1989).
Общий потенциал устойчивости к предуборочному прорастанию основывается на множестве различных признаков, таких как цвет зерна, время уборки урожая, глубина покоя семян и скорость поглощения воды, скорость деградации крахмала при прорастании. Кроме того на прорастание зерна в колосе оказывает влияние его морфологическое строение: степень закрытия зерна цветковыми чешуями и прочность чешуй наличие остей, опушенность колоса, наличие воскового налета, окраска цветковых чешуй (King, 1984; Walker-Simmonds, 1987; Paterson et al., 1989; Gatford et al., 2002, Groos et al., 2002; Himi et al., 2002; Rathjen et al., 2007; Farley and Adkins 2007).
Ряд таких просто наследуемых морфологических особенностей колоса могут влиять на интенсивность увлажнения зерна во время дождя и тем самым ограничивать предуборочное прорастание в колосе (King, 1984). Так, безостые колосья пшеницы, во время моделируемого дождя, поглощают воду более медленно, чем остистые, что уменьшает предуборочное прорастание в колосе вдвое (King & Richards, 1984). Семенная кожура является основным барьером, препятствующим всасыванию воды и предупреждающим предуборочное прорастание. Без защитных семенных покров вода беспрепятственно бы поступала в клетки алейронового слоя активировала -амилазу и провоцировала бы прорастание. У сортов устойчивых к предуборочному прорастанию семена имеют плотное расположение эпидермальных клеток, которые способствуют задержке поглощения воды (Chen et al., 2008; Kong et al., 2008).
Определенное влияние на интенсивность прорастания зерна в колосе оказывает и окраска его колосковых чешуй. Сдерживающее действие колосковых чешуй при воздействии неблагоприятных условий наиболее заметно в первые сутки при наклевывании зерна. Установлено, что больше всего сдерживают наклевывание семян вытяжки из колосковых чешуй краснозерной пшеницы, а меньше всего - из колосковых чешуй ржи (Беркутова и Буко, 1982).
Проблема прорастания на корню распространена во всех зонах возделывания зерновых злаков. Предуборочное прорастание связано с высокой влажностью, длительными дождями и обильными росами в период созревания зерна (Nielsen et al., 1984). Усугубляет ситуацию задержки в уборке урожая, вызванные длительными осадками. Даже в районах с сухим климатом данная проблема имеет место. Например, в штате Канзас в США, характерным жарким засушливым климатом в определенные годы были зафиксированы потери урожая от прорастания на корню (Derera, 1989). В России в погодно-климатических условиях Краснодарского края проблема предуборочного прорастания встречается редко, однако, при дождливой погоде во время уборки урожая восприимчивые сорта пшеницы также прорастают на корню (Беспалова, 2012).
Предуборочное прорастание – проблема, затрагивающая все злаковые культуры. Наиболее склонна к предуборочному прорастанию рожь (Secale cereale L.), из-за открытого строения колосковых чешуй, в связи с чем, к зерновкам легко попадает влага. У тритикале (xTriticosecale Wittmack), как и у ржи часто встречаются случаи предуборочного прорастания, что сильно влияет на качество производимой муки. Ячмень (Hordeum vulgare L.) так же подвержен данной проблеме, которая наносит ущерб производству перловой и ячневой крупы, и негативно влияет на соложение в пивоварении. В северных районах у овса (Avena sativa L.) возникают случаи предуборочного прорастания, что снижает качество производимой геркулесовой крупы.
Часто прорастание на корню затрагивает и мягкую пшеницу, это связано с большими объемами выращивания данной культуры и регионами, способствующими предуборочному прорастанию, в которых она возделывается. Прорастание зерна в колосе до уборки способствует снижению урожая и его качества. Последствия предуборочного прорастания зависят от того, для производства какого продукта будет использовано зерно.
Липкость теста и сыропеклость хлеба связана с повышением активности -амилазы, что приводит к гидролизу гранул крахмала и образованию водорастворимых декстринов (Kruger, 1989). Идентифицировано три группы -амилаз. В первую группу входит -амилаза 1 (-Amy1), которую так же называют солодовой. В мягкой пшенице идентифицированы и локализованы на длинном плече шестой хромосомы (6AL, 6BL, 6DL) три гена-ортолога -амилазы (-Amy-A1, -Amy-B1 и -Amy-D1) (McIntosh et al.,2009). Уровень экспрессии может регулироваться гибберелиновой кислотой (ГК). Уровень экспрессии второй группы «зеленой» -амилазы (-Amy2) так же регулируется ГК, но ее синтез находится под контролем седьмой гомеологичной группы хромосом. В третью группу входит термолабильный изофермент перекарпия (-Amy3). Mrva и Mares (2001) продемонстрировали наличие в зерне ряда генотипов -амилазы позднего созревания. Ими было показано, что подобная форма фермента, приводящая к преждевременному прорастанию созревающего зерна в отсутствии высокой влажности, является результатом генетического дефекта. Данный дефект был выявлен у некоторых генотипов пшеницы. Ферменты липазы и протеазы, также принимают участие в процессе прорастания.
При прорастании семени увеличивается активность фермента пероксидазы, которая осуществляет контроль за уровнем перекиси водорода, восстанавливая ее до воды и окисляя низкомолекулярные антиоксиданты. При этом высокая концентрация антиоксидантов способна снижать активность фермента (Рогожин и Рогожкина, 2011).
Выделение ДНК из растительного материала
Генетический материал пырея несет в себе как положительные (устойчивость к биотическим и абиотическим факторам, качественные запасные белки), так и отрицательные нежелательные признаки (низкая продуктивность, ломкий колос, позднее созревание и др.). Поэтому пшенично-пырейные амфиплоиды или промежуточные пшенично-пырейные гибриды (ПППГ) в первую очередь важны, как исходный селекционный материал для создания интрогрессивных линий, несущих благоприятные гены пырея при минимальном количестве «генетического мусора».
Генетическая эрозия пшеницы привела к масштабным исследованиям по пополнения генофонда пшеницы третичным генофондом дикорастущих злаков. Работы по созданию интрогрессивных линий пшеницы, несущих фрагменты хромосом пырея не потеряли свою актуальность. (Плотникова, 2014; Давоян, 2015)
В настоящее время вновь возрос интерес к многолетним пшеницам, как в России (Упелниек, 2012) так и в других странах мира, таких как США, Австралия и Италия (Cox, 2010; Turner et al., 2013; Pogna, 2014), что связано с направленностью мирового сообщества на экологическое земледелие. Возделывание многолетней пшеницы потенциально привело бы к снижению числа обработок почвы, экономии ресурсов на однократном посеве и вспашке (Jaikumar et al., 2012). Многолетняя пшеница представляет собой пример «преобразующей технологии», имеющей ряд технологических и экономических преимуществ перед однолетними культурами: многолетняя пшеница способна снизить нагрузку на окружающую среду и способна давать стабильные урожаи на маргинальных землях (Adebiyi et al., 2015; Lloyd, 2015) Наследование устойчивости к ряду болезней и вредителей от пырея позволило бы снизить нагрузку пестицидов на агрофитоценоз. Способность ППГ к отрастанию, могла бы послужить благоприятным фактором при использовании растений на пастбищах для корма скоту. Кроме того в условиях изменения климата многолетние пшеницы способны переживать как низкие температуры за счет морозостойкости перенесенной от пырея и устойчивости к снежной плесени, так и засухи, благодаря развитой корневой системе (Цицин, 1978; Snapp, 2008).
Как и в случае трибы пшеницевых из-за разнообразия таксономических систем классификации не существует единого мнения в отношении таксономии ППГ. Описывая полученные им ППГ, Н.В. Цицин относил их к новому виду октоплоидной пшеницы Triticum agropyrotriticum Cicin. (Цицин, 1978). Объединив два родовых названия Triticum и Elytrigia Н.Н Цвелев присвоил ППГ латинское название Trititrigia Tzvel., которое широко используется некоторыми исследователями и в наше время (Yan-Ming et al., 2010). Некоторые авторы использовали термин Agrotriticum, который происходит он сочетания родовых названий пырея (Agropyrum) и пшеницы (Triticum) (Yuan et al., 1997, Ruz, 2009). Иногда в литературе встречается название Tritipyrum (Triticum+Thinopyrum) (Baghizadeh and Karimzadeh, 2009; Siahsar et al., 2010; Mirzaghaderi et al., 2010).
По своим морфологическим и биологическим признакам ППГ занимают промежуточное положение между пыреем и пшеницей. Вследствие использования в гибридизации различных видов пырея, отличающихся высоким разнообразием и различий в геномном составе, ППГ проявляют высокую степень морфологического полиморфизма.
Наблюдается большое варьирование по морфологии колоса: по длине колоса от (10-27 см), по форме колоса (веретеновидная, цилиндрическая) по окраске (белый, красный), по остистости (остистый, безостый), по опушенности, по цвету зерна (белое, красное, зеленое, фиолетовое). По остистости гибридов проводят более глубокое разделение, измеряя длину остей (Рис. 6). По структуре колоса ППГ можно выделять три типа, в зависимости от степени проявления пырейных и пшеничных признаков. К первому типу принадлежат плотные и широкие (лицевая сторона шире боковой) колосья пшеничного типа, с выполненными зерновками от 40- до 80 штук на колос. Второй тип характеризуется промежуточным положением. К третьему типу относятся формы с выраженным пырейным типом колоса. Колос рыхлый с низкой плотностью, часто ломкий, его длина превышает 20 см. Формы пырейного типа и по физиологическим признакам, таким как замедленное развитие и позднее созревание, зимостойкость и многолетность приближены к пырею. (Цицин, 1976; Упелниек,2012)
Клонирование гаплотипов гена Vp-1 дикорастущих сородичей пшеницы
В результате проведения работ по лигированию амплифицированной ДНК в вектор, клонированию полученных конструкций в бактериальных клетках, отбору клонов с помощью ПЦР с праймерами М13, размножение и криоконсервации в общей сложности было проанализировано более 1000 клонов.
При секвенировании клонированных фрагментов ДНК нами так же учитывалась возможность, что при амплификации с праймерами участвующими в нашей работе могли амплифицироваться фрагменты ДНК и с других транскрипционных факторов. И вероятность этого тем более велика, из-за того, что различные транскрипционные факторы имеют много общих консервативных последовательностей. Таким образом, клонированные нами последовательности могли относиться и к другим генам помимо гена Vp-1.
В связи со всем вышеизложенным тотальное секвенирование всех полученных нами клонов было бы нецелесообразно. Поэтому мы использовали следующую схему работы: 1. С максимальной точностью определяли размеры клонированных последовательностей и разделяли их по классам в соответствии с размерами. 2. Секвенировали по два клона из каждого класса только с одного праймера M13F. 3. С помощью Blast определяли, какой из классов клонов гомологичен гену Vp-1. 4. Секвенировали с обеих сторон клоны, относящие к классу, по которому были получены сиквенсы гомологичные гену Vp-1 . При этом в случае аллополиплоидных видов Thinopyrum intermedium и Thinopyrum ponticum секвенировали все клоны, относящиеся к искомому классу. Так же предпочтение отдавалась клонам, нуклеотидная последовательность которых приходилась на одну и ту же часть гена, но полученным с различных праймеров, для более достоверной верификации данных. В случае диплоидных видов (Pseudoroegneria spicata, Thinopyrum bessarabicum, Dasypyrum villosum) секвенировали минимум пять клонов для выявления возможных аллельных вариантов и получения консенсусного сиквенса.
Полученные нами клоны по некоторым частям гена не отличались по размеру друг от друга. Чтобы не секвенировать тотально все клоны и при этом не потерять полиморфизм по аллельным вариантам и гаплотипам мы использовали скрининг «часторежущими» рестриктазами. Для секвенирования отбирались клоны с различной картиной рестрикции. (Рис.8) 68 а b Рисунок 8 a) Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймеров М13 F/R до рестрикции Th. intermedium; b) Электрофореграмма продуктов ПЦР c праймерами M13 F/R с последующей рестрикцией Msp I на Th. intermedium. В результате на секвенирование было отобрано около 450 клонов.
Для амплификации «части I» гена Vp-1 Thinopyrum intermedium использовали праймеры Vp-1A3 F/R, разработанные на «часть I» Vp-1 мягкой пшеницы (Yang, 2007). После клонирования, отбора клонов с помощью бело голубой селекции и амплификации клонов на праймерах M13 было проведено секвенирование. В результате секвенирования клонов относящихся к «части I» гена Vp-1 Th. intermedium были получены шесть консенсусных нуклеотидных последовательностей размером 1229, 1235, 1250 и три последовательности по 1253 п.н.
В результате BLAST анализа в базе данных GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) нуклеотидные последовательности показали высокую степень гомологии (93-95%) к генам Vp-1 различным видам трибы пшеницевых. Значение E-value = 0,0, что свидетельствует о статистической значимости гомологии полученных нуклеотидных последовательностей.
Для амплификации «части I» гена Vp-1 Thinopyrum ponticum так же, как и для пырея среднего мы использовали праймеры Vp-1A3F/R (Yang, 2007). После клонирования и секвенирования для «части I» гена Vp-1 Th. ponticum в общей сложности были получены пятнадцать нуклеотидных последовательностей гомологичных гену Vp-1. Полученные нуклеотидные последовательности имели размеры: восемь по 1235, две по 1244, три 1256 и одна 1259 п.н. В результате BLAST анализа все нуклеотидные последовательности показали высокую степень гомологии (93-98%) к генам Vp-1 различных видов трибы пшеницевых. «Часть I» гена Vp-1 представлена часть первого экзона, при анализе полученных последовательностей Th. intermedium и Th. ponticum не было выявлено стоп-кодонов и сдвига рамки считывания за счет инсерций или делеций не кратных трем. Таким образом, можно предположить, что полученные нами последовательности являются частями функционирующих генов.
Для амплификации «части I» гена Vp-1 Pseudoroegneria spicata были так же использованы праймеры Vp-1A3F/R (Yang, 2007). Для «части I» гена Vp-1 Ps. spicata были получены две консенсусные нуклеотидные последовательности размером 1253 пн. В результате BLAST анализа нуклеотидные последовательности показали высокую степень гомологии (95%) к генам Vp-1 злаков.
У одной нуклеотидной последовательности pssp1.2, размером 1253 п.н., выявлен сдвиг рамки считывания в районе 192 нуклеотида из-за делеции в 2 п.н. Таким образом, данная последовательность является псевдогеном.
Оценка коллекции ППГ на показатели покоя семян
Для амплификации «части IV» гена Vp-1 Thinopyrum intermedium использовали праймеры Vp-BB4 F/R (Yang, 2007). После клонирования было проведено секвенирование и в результате у Th. intermedium были получены шесть консенсусных нуклеотидных последовательностей размером 874, 883, 888, 890, 909 и 937 пн. В результате BLAST анализа все нуклеотидные последовательности показали высокую степень гомологии (86-90%) к генам Vp-1 различных видов трибы пшеницевых.
Для амплификации «части IV» гена Vp-1 Thinopyrum ponticum использовали праймеры Vp-BB4 F/R (Yang, 2007).В результате клонирования и секвенирования Th. ponticum были получены десять консенсусных нуклеотидных последовательности размером 872, 880, три по 883, 886, 888, 890, 902 и 1324 пн. В результате BLAST анализа все нуклеотидные последовательности показали высокую степень гомологии (85-90%) к генам Vp-1 различных видов трибы пшеницевых.
Для амплификации «части IV» гена Vp-1 Thinopyrum bessarabicum были использованы праймеры Vp-1BB4F/R (Yang, 2007). В результате клонирования и последующего секвенирования была получена одна консенсусная нуклеотидная последовательность размером 914 пн. В результате BLAST анализа нуклеотидная последовательность показала степень гомологии в 90% к генам Vp-1 трех видов пшеницы.
Для амплификации «части IV» гена Vp-1 Pseudoroegneria были использованы праймеры Vp-1BB4F/R (Yang, 2007). После клонирования и секвенирования была получена одна консенсусная нуклеотидная последовательность размером 883 пн. В результате BLAST анализа нуклеотидная последовательность показала степень гомологии в 88% к генам Vp-1 трех видов пшеницы.
Для амплификации «части IV» гена Vp-1 Dasypyrum villosum были использованы те же праймеры Vp-1BB4F (Yang, 2007). По результатам клонирования и секвенирования были получены две консенсусные нуклеотидные последовательности размером 866 и 1029 пн. В результате BLAST анализа нуклеотидные последовательности показали высокую степень гомологии (88-92%) к генам Vp-1 трех видов пшеницы.
«Часть IV» гена Vp-1 представлена частью пятого экзона, 6 экзоном,5 интроном и последовательностью следующей за транслируемой областью гена Vp-1. При анализе полученных последовательностей стоп-кодонов и сдвига рамки считывания выявлено не было.
В итоге для «части IV» гена Vp-1 были получены сиквенсы: 6 последовательностей Th. intermedium и 10 - Th. ponticum, 1 – Th. bessarabicum, 1 – Ps. spicata и 2 - Dasypyrum villosum. Выравнивание полученных последовательностей друг с другом и с тремя генами Vp-1 трех различных субгеномов мягкой пшеницы представлено на Рисунке 13.
В интроне 5 присутствует большое количество крупных инсерций у последовательностей гомологов гена Vp-1 мягкой пшеницы.
В первую очередь обращают на себя внимание инделы делящие полученные нуклеотидные последовательности на две группы: по наличию-отсутствию. В районе 260 нуклеотида выявлена делеция 20 пн, делящая нуклеотидные последовательности на две группы по наличию делеции (thint4.5, thint4.6, thpon4.5, thpon4.7, thpon4.8, pssp4.1) и ее отсутствию (thint4.1, thint4.3, thint4.4, thint4.7, thpon4.1, thpon4.2, thpon4.3, thpon4.4, thpon4.6, thpon4.9, thpon4.10, thbes4.1). При этом у нуклеотидной последовательности dvil4.1 в этом районе обнаружена делеция 32 пн, а у thint4.2 вставка в 4 пн (рис. 14, делеция D). В районе c 420 по 590 нуклеотид имеется индел 23 пн, обрамляющий инсерцию выявленную у последовательности гена A-генома мягкой пшеницы по 11-15 пн с 5 -конца и по 12-16 пн с 3 -конца (рис14, индел G). У последовательностей thint4.2, thint4.4, thint4.5, thint4.6, thpon4.5, thpon4.8, Th. выявлена инсерция 23 пн (11 пн с 5 -конца и 12 пн с 3 -конца). У последовательностей thpon4.1 и thpon4.9 - вставка 31 пн (15 пн с 5 -конца и 16 пн с 3 -конца) (рис. 13, индел G). У нуклеотидной последовательности thpon4.4 инсерция составляет 18 пн (11 пн с 5 -конца и 7 пн с 3 конца), а за инсерцией следует делеция в 4 пн.