Введение к работе
Актуальность темы. Наиболее частыми хромосомными нарушениями у человека являются аномалии половых хромосом [Бочков, Стонова, 1969], среди которых существенное клиническое значение имеет моносомия X, или синдром Шерешевского-Тернера (СШТ). Частота этого синдрома в различных популяциях мира по данным разных авторов колеблется от 1 до 7 на 10.000 новорожденных девочек [Давыденкова с.соавт., 1973; Осипова, 1997; Nielsen, Wohlert, 1990].
Клиническая картина СШТ отличается большим разнообразием, однако генетические механизмы, лежащие в основе патогенеза СШТ, до сих пор не выяснены [Ogata, Matsuo, 1995]. При проведении хромосомного анализа у пациентов с СШТ часто выявляется мозаицизм с присутствием, наряду с Х-моносомным клеточным клоном, клеток с нормальной 46.ХХ-или 46,XY-xpoMocoMHofi конституцией, клеточных линий с полисомией X или клонов со структурно измененной половой хромосомой [Palmer, Reichmann, 1976; Kleczkovvska et al., 1990; Nielsen, Wohlert, 1990]. Кроме того, не исключено, что существует межтканевая вариабельность содержания анеуплоидного клеточного клона у одних и тех же больных с мозаичным вариантом СШТ. Такое генетическое разнообразие затрудняет проведение исследований по фено-кариотнпическим корреляциям у этих больных. Несомненно, что повышение качества диагностики патологии путем вовлечения методов молекулярно-генетического анализа с исследованием хромосомной конституции разных тканей больных будет способствовать решению этих проблем. К таким методам, в частности, относится флюоресцентная гибридизация in situ (FISH), позволяющая исследовать большое число ядер, в том числе и неделящихся in vitro, с анализом количества тех или иных хромосом набора [Miharu et al., 1994; Guttenbach et al., 1995; Robinson et al., 1995]. Кроме того, большие возможности для диагностики наследственной патологии предоставляет ПЦР-анализ полиморфных молекулярно-генетическігх маркеров, локализованных на исследуемых хромосомах, который позволяет выявлять числовые и структурные мутации хромосом и определять родительское происхождение хромосомного дисбаланса [Hassold et al., 1992; Binder et al., 1995; Larsen et al., 1995; Yorifuj'i et al., 1997].
Хотя в популяциях человека чаще встречается мозаичный вариант СШТ, лишь единичные работы посвящены изучению влияния частоты 45,Х-клеточного клона на фенотипическую изменчивость и вариабельность клинических признаков у больных [Ikeda et al., 1982; Sarkar, Marimuthu,
1983; Kaiser, Abt, 1996]. Общепринятое представление о прямой зависимости между долей Х-моносомного клеточного клона и тяжестью клинических проявлений СШТ и изменением антропометрических показателей у больных с мозаицизмом нуждается в проверке, с выявлением конкретных признаков, связанных с изменением величины анеуплоидного клона. Следует отметить, что все предыдущие исследования проводились с анализом доли анеуплоидного клеточного клона только в одной ткани - лимфоцитах периферической крови. В настоящее время с помощью молекулярно-генетических методов можно провести такое исследование с учетом хромосомной конституции в клетках разного зародышевого происхождения. Вычленение диагностически значимых признаков, даже при относительно небольшом проценте Х-анеуплоидного клеточного клона, важно для клинической практики - как при первичном клиническом осмотре больного и принятии решения о необходимости его дальнейшего цитогенетического обследования, так и при медико-генетическом консультировании, лечении и реабилитации лиц с мозаичными формами данного заболевания.
У абортусов с хромосомными нарушениями частота встречаемости моносомнн X достигает 20% [Назаренко, 1993; Hassold et al., 1980; Rehder et al., 1989]. Только около 1% эмбрионов с моносомией X продолжают развитие, что приводит к рождению детей с СШТ. Трудно объяснить низкую выживаемость плодов с моносомией X, поскольку больные с СШТ редко имеют несовместимые с жизнью пороки развития [Canci et al., 1988]. В связи с новыми данными о роли эпигенетической модификации некоторых участков хромосом и феномена геномного импринтинга в развитии организма появилась гипотеза о возможном влиянии . родительского происхождения единственной Х-хромосомы на жизнеспособность эмбрионов с моносомией X [Hassold et al., 1988; Jacobs et al., 1990; Villamar et al., 1990]. Однако до настоящего времени эта гипотеза была тестирована на ограниченном материале и нуждается в дальнейшей проверке.
Цель работы. Молекулярно-генетический анализ и фенотипическое проявление чистых и мозаичных форм синдрома Шерешевского-Тернера в зависимости от доли Х-анеуплоидного клеточного клона и родительского происхождения моносомии X.
Задачи исследования:
1. Провести исследование анеуплоидии Х-хромосомы в клетках разных тканей у женщин с нарушением полового развития с помощью интерфазного FISH-анализа.
2. Сравнить эффективность диагностики моносомии Х-хромосомы с
помощью метода интерфазного FISH-анализа и стандартного
цитогенетического анализа.
3. Оценить изменчивость антропометрических показателей в
зависимости от доли Х-моносомного клеточного клона в тканях разного
зародышевого происхождения.
4. Исследовать влияние частоты Х-моносомного клона в клетках
разных тканей на степень проявления интегральных клинических признаков
у пациентов с синдромом Шерешевского-Тернера.
5. Определить родительское происхождение анеуплоидии у
спонтанных абортусов и больных с синдромом Шерешевского-Тернера,
оценить влияние родительского происхождения анеуплоидии на
выживаемость эмбрионов и плодов с моносомией X.
Научная новизна. Обнаружены существенные межтканевые различия по содержанию клеточных клонов у большинства больных с мозаичным вариантом СШТ. Впервые с помощью метода FISH-анализа интерфазных клеток различных тканей выявлены больные со сверхнизкой долей X-моносомного клеточного клона, которые ранее, при традиционном цитогенетическом исследовании, практически не выявлялись. Определены. конкретные антропометрические показатели и клинические признаки, положительно и отрицательно коррелирующие с частотой Х-моносомного клеточного клона у больных с мозаичной формой синдрома. Рассмотрена изменчивость соматометрических признаков и изучено клиническое проявление заболевания у больных со сверхнизкой долей Х-моносомного клеточного клона. В работе исследован ряд полиморфных молекулярно-генетических маркеров Х-хромосомы и определена их информативность для анализа родительского происхождения моносомии X и диагностики анеуплоидных состояний.
Практическая ценность. Проведенное исследование показало, что комплекс цитогенетических и молекулярно-генетических методов позволяет существенно улучшить диагностику различных вариантов СШТ. Установлено, что дискриминантный анализ антропометрических показателей, на изменчивость которых влияет частота Х-моносомного клеточного клона, позволяет с высокой точностью разделять больных с СШТ на группы, отличающиеся по степени мозаицизма. Создан банк ДНК семей, имеющих ребенка с синдромом Шерешевского-Тернера или спонтанный абортус с моносомией X. Проверенные в ходе настоящего исследования 6 полиморфных локусов Х-хромосомы и альфоидный повтор из центромерного района Y-хромосомы могут быть использованы в
6 практической работе для анализа сцепления и статуса носительства некоторых мутантных генов Х-сцепленных заболеваний у больных, а также для определения пола плода в пренаталыюн диагностике этих заболеваний. Положения, выносимые на защиту:
1. Эффективная диагностика анеуплоидии Х-хромосомы обеспечивает
ся комплексом цитогенетических и молекулярно-генетических методов
исследования разных тканей больных с нарушением полового развития.
-
Интерфазный FISH-анализ клеток тканей, происходящих из различных зародышевых слоев, высоко информативен для выявления малых клеточных клонов с числовыми хромосомными нарушениями.
-
У больных с мозаичным вариантом синдрома Шерешевского-Тернера выявлен комплекс конкретных антропометрических показателей и клинических признаков, изменчивость которых коррелирует с изменением доли Х-моносомного клеточного клона.
-
Дискриминантный анализ комплекса антропометрических показателей позволяет с высокой точностью классифицировать больных, различающихся по доле Х-моносомного клеточного клона.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на: международной конференции «Геномный импринтинг» (Флоренция, Италия, 1994); конференции НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 1997); Научных чтениях, посвященных 100-летию профессора В.П.Чехова (Томск, 1997); 30 конференции Европейского общества по генетике человека (Лиссабон, Португалия, 1998); межлабораторном семинаре НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 1998).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов собственных исследований с обсуждением по разделам, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 135 страницах текста, содержит 14 таблиц, 7 рисунков. Список литературы включает 240 источников, из них 38 отечественных и 202 зарубежных.