Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 .Этиология и патогенез псориаза 12
1.2.Клиника псориаза 19
1.3.Генетические аспекты псориаза 23
1.3.1. Гены главного комплекса гистосовместимости 1 23
Гены HLA-C 25
ГеяНСЯ 27
Ген S(CDSN) 29
Ген SEEK (PSORS1C1) uSPR (PSORS1C2) 31
1.3.2. Гены цитокинов 33
ГеныГМ^ 34
Гены IL-1 и IL-1RA 36
TQKILIO 38
1.33.ГенС7ЪА4 40
1.3.4. Семейство генов S100 41
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1 .Материалы исследования 44
2.2.Методы исследования 45
2.2.1. Выделение геномной ДНК 45
2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 46
2.2.3. Рестрикционный анализ 47
2.2.4. Метод электрофореза 47
2.3. Генотипирование с использованием SNPlex платформы (Applied Biosystems) 48
2.4. Статистическая обработка результатов 52
2.5. Web ресурсы, используемые в данном исследовании 55
Глава 3. Результаты и обсуждение 56
3.1.Исследование полиморфных вариантов генов HLA-C, HCR и CDSN хромосомного региона PSORS1 (6р21.3) и TNFA главного комплекса гистосовместимости (МНС) 56
3.1.1. Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов HLA-C, HCR и CDSN хромосомного региона PSORS1 (6р21.3) и
TNFA 57
Анализ ассоциаций полиморфного локуса Cw6 гена HLA-C с псориазом 57
Анализ ассоциаций полиморфных локусов G305A, С307Т, С325Т, Т477С, G1723T, A1911G, C2327G гена HCR с псориазом 66
Анализ ассоциаций полиморфного локуса C1243Trena.CDSN с псориазом 83
Анализ ассоциаций полиморфного локуса G308A гена TNFA с псориазом : 92
3.2.Анализ неравновесия по сцеплению между парами маркеров генов HLA-С, HCR и CDSN хромосомного региона PSORS1 (6р21.3) и TNFA
главного комплекса гистосовместимости (МНС) 96
3.3.Реконструкция и анализ ассоциаций гаплотипов полиморфных локусов генов HLA-C, HCR и CDSN хромосомного региона PSORS1
(6р21.3) 102
3.4. Анализ роли межгенных взаимодействий в формировании редрасположенности к псориазу 112
3.5.Поиск ассоциаций с псориазом полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA в семьях 121
3.6. Анализ ассоциаций 48 полимофных вариантов генов семейства Toll- 123
подобных рецепторов - TLR (1-10) с псориазом
Заключение 132
Список литературы
- Гены главного комплекса гистосовместимости
- Выделение геномной ДНК
- Генотипирование с использованием SNPlex платформы (Applied Biosystems)
- Анализ ассоциаций полиморфного локуса Cw6 гена HLA-C с псориазом
Введение к работе
Актуальность проблемы
Распространенные хронические заболевания, в этиологии которых существенную роль играет генетическая компонента, но характер наследования не может быть объяснен простыми менделевскими правилами, образуют группу многофакторных заболеваний [Гинтер Е.А., 2003]. Такие патологии в настоящее время приобретает все большее значение для медико-генетического консультирования и практического здравоохранения, так как в среднем около 10% населения страдает болезнями с наследственной предрасположенностью, а их доля среди общего числа случаев наследственной патологии человека достигает 90% [Иванов В.И., 2006].
Примером многофакторного заболевания, когда изменчивость того или иного признака определяется не одним главным геном, а влиянием большого числа генетических и внешнесредовых факторов, является псориаз [Campalani et al., 2005]. Псориаз - один из наиболее распространенных хронических воспалительных дерматозов, характеризующийся гиперпролиферацией эпидермиса и нарушением кератинизации [Скрипкин Ю.К., 2005]. Известно, что псориазом страдают 0,3-7 % населения во всем мире [Campalani et al., 2005]. Согласно последним данным Международной Организации Псориаза 125 миллионов людей в мире имеют псориаз. Псориаз представляет собой системный процесс с выраженными функциональными и морфологическими изменениями ряда органов и систем организма. У больных псориазом наблюдаются проявления нарушений функций центральной, периферической и вегетативной нервной системы, эндокринных желез, метаболические изменения, особенно выраженные при остром и распространенном псориазе [Скрипкин Ю.К., 2005]. Приблизительно у 15-40% больных псориазом развивается псориатический артрит, часто с множественным поражением
суставов, приводящих нередко к инвалидизации, что в значительной степени усугубляет качество жизни больных. По меньшей мере, у 30% больных, имеющих псориаз наряду с другими серьезными заболеваниями, такими как депрессия, заболевания сердечно-сосудистой системы и диабет, отмечена склонность к суицидам [Krueger, 2001; Mallbris et al., 2004]. В связи со значительной распространенностью заболевания, хроническим и зачастую, тяжелым течением, несовершенством имеющихся методов лечения, неясностью этиологии и патогенеза, проблема псориаза является одной из актуальных в медицине.
Несмотря на длительную историю изучения псориаза, этиология и патогенез заболевания окончательно не выяснены, что значительно затрудняет разработку оптимальных и эффективных методов терапии и возможность добиться длительной клинической ремиссии. В настоящее время признана точка зрения, согласно которой псориаз является многофакторным заболеванием, на развитие которого влияют как генетические факторы, так и факторы внешней среды (травматические, нервно-психические, применение некоторых медикаментов, злоупотребление алкоголем, курение, инфекционные заболевания и т.д.) [Bowcock et al., 2005]. Генетические факторы доминируют над средовыми, о чем свидетельствуют высокие значения коэффициента наследуемости псориаза. Вместе с тем средовая компонента, играя определенную роль в возникновении дерматоза, оказывает значительное влияние на характер течения и прогноз уже развившейся болезни.
Многочисленные популяционные, семейные исследования и изучения конкордантных и дискордантных по заболеванию близнецов, проводимые во всем мире, указывают на значительную роль генетических факторов в развитии псориаза [Bowcock et al., 2005; Campalani et al., 2005; Rahman et al., 2005]. Молекулярно—генетические исследования псориаза проводятся с помощью анализа сцепления и ассоциаций, исследования экспрессии генов, модельных
животных и др. [Bowcock et al., 2005]. В настоящее время опубликованы данные об ассоциации и сцеплении, по меньшей мере, 19 геномных локусов с различными формами псориаза [Nair et al., 2006]. Международный консорциум по изучению генетики псориаза провел анализ сцепления 14-ти локусов кандидатов в выборке 942 пораженных пар сибсов, при этом максимальный LOD-балл был получен для локуса PSORS1 в хромосомном регионе 6р21.3, где идентифицировано 11 генов -HLA-C [Schmitt-Egenolf et al., 1996], HCG27 [Nair et al., 2006], PSORS1C3 [Nair et al., 2006], OTF-3 [Takeda et al., 1992], TCF19 [Ku et al., 1991], HCR [Oka et al., 1999], SPR1 [Oka et al., 1999], SEEK1 [Oka et al., 1999], CDSN [Zhou and Chaplin., 1993], STG [Oka et al., 1999], HCG22 [Nair et al., 2006]. Часть из этих генов открыта сравнительно недавно и мало изучена их роль в патогенезе псориаза. Кроме того, возможно участие в формировании предрасположенности к псориазу генов, расположенных за пределами главного комплекса гистосовместимости (МНС, Major histocompatibility complex): гены цитокинов (факторы некроза опухоли - TNFA и TNFB и ряд интерлейки нов, в частности, IL1 (участок 2ql2-2ql3) и семейство генов IL10 (участок Ц31-32), ген CTLA4 (участок 2q33), семейство генов S100 (1 q21) [Bowcock et al., 2005].
Идентификация специфичных генов, вовлеченных в патогенез псориаза, и анализ взаимодействия генома и факторов окружающей среды будут способствовать формированию фундаментальных представлений о генетических, иммунных и патогенетических аспектах псориаза. И как следствие, понимание генетических механизмов развития заболевания имеет существенное значение для определения подходов к профилактике псориаза в отягощенных семьях и для разработки оптимальных и эффективных методов терапии.
В соответствии с вышеизложенным были поставлены цель и задачи исследования.
Цель исследования
изучение роли генов главного комплекса гистосовместимости и генов семейства Толл-подобных рецепторов в формировании предрасположенности к псориазу.
Задачи исследования
Провести у больных псориазом и здоровых индивидов:
1. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов
Cw6 nam HLA-C, G305A, С307Т, С325Т, Т477С, G1723T, A1911G, C2327G гена
HCR, С1243Т гена CDSN и G308A гена TNFA главного комплекса
гистосовместимости (МНС).
2. Анализ ассоциаций исследованных полиморфных вариантов генов HLA-
С, HCR, CDSN и TNFA с риском развития псориаза у индивидов с учетом
этнической принадлежности, клинических форм и возраста начала развития
болезни.
Анализ неравновесия по сцеплению между полиморфными локусами генов HLA-C, HCR, CDSN я TNFA.
Анализ ассоциаций гаплотипов полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN я TNFA с псориазом.
Оценку роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к псориазу.
Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA с риском развития псориаза в семьях с повторными и множественными случаями псориаза с помощью теста на неравновесную передачу.
Исследование полиморфных вариантов генов семейства Толл-подобных рецепторов TLR с использованием SNPlex платформы (Applied Biosystems).
Научная новизна исследования
Впервые создан банк ДНК больных псориазом и здоровых индивидов четырех этнических групп, проживающих на территории России — русских, татар, башкир и хакасов, общей численностью 1222 индивида. Впервые проведен молекулярно-генетический анализ полиморфных локусов генов HLA-С, HCR, CDSN и TNFA у больных псориазом и здоровых индивидов. Определены генетические маркеры риска развития заболевания у индивидов с учетом этнической принадлежности, клинических форм и возраста начала развития псориаза и оценена роль взаимодействия изученных генов в формировании предрасположенности к псориазу. Выявлен гаплотип по полиморфным локусам генов PSORS1, ассоциированный с риском развития псориаза у лиц русской, татарской и хакасской этнической принадлежности. Получены данные об ассоциации полиморфных вариантов генов PSORS1 с риском развития псориаза в семьях с повторными и множественными случаями псориаза. Впервые проведено исследование 48 полиморфных вариантов генов семейства Toll-подобных рецепторов — TLR (1-10) с использованием SNPlex платформы (Applied Biosystems) и установлено, что полиморфные варианты генов TLR3 и TLR7 маркируют повышенный риск развития псориаза у лиц русской и татарской этнической принадлежности.
Научно — практическая значимость работы
Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к псориазу. Впервые получены статистические оценки частот аллелей и генотипов исследуемых ДНК-локусов у больных псориазом. Получены новые данные о влиянии исследуемых ДНК-локусов на риск развития псориаза у больных с учетом этнической принадлежности, клинических форм и возраста начала развития болезни. В клинической практике тестирование полиморфизмов генов-кандидатов псориаза может быть
применено для определения подходов к профилактике псориаза в отягощенных семьях и для разработки оптимальных и эффективных методов терапии.
Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития псориаза.
Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских высших образовательных учреждениях, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Основные положения, выносимые на защиту
Аллель Cw6+, генотипы Cw6+/Cw6+ и Cw6+/Cw6- гена HLA-С — маркеры повышенного риска развития псориаза у лиц русской, татарской, башкирской и хакасской этнической принадлежности.
Ассоциация с псориазом аллелей 307*Т, 325*Т, 1723*Т, 1911*G, 2327*Gr генотипов 307*Т/Т, 325*С/Т, 325*Т/Т, 1723*С/Т, 1723*Т/Т, 2327*C/G, 2327*G/G гена HCR во всех изученных этнических группах.
Ассоциация аллеля 1243*С гена CDSN с псориазом у индивидов русской и татарской этнической принадлежности, аллеля 1243 *С и гомозиготного генотипа 1243*С/С гена CDSN с вульгарным псориазом и с началом развития заболевания до 40 лет.
Ассоциация гаплотипа HLA-Cw6+/HCR-307*T/HCR-325*T/HCR-477*C/HCR-1723*T/HCR-1911*/-HCR-2327*G/CDSN1243*C с псориазом у лиц русской, татарской и хакасской этнической принадлежности
Детерминация риска развития псориаза взаимодействием полиморфных вариантов генов HLA-C и HCR: HLA-Cw6, HCR-C307T, HCR-C325T, HCR-G1723T, HCR-C2327G
Гены главного комплекса гистосовместимости
Происходит нарушение кератинизации, обусловленное увеличением скорости пролиферации и значительным нарушением нормальной дифференцировки эпидермальных кератиноцитов. Гиперпролиферация эпидермиса — это ключевой патофизиологический процесс при псориазе, поэтому изучение ее пусковых механизмов является основополагающим моментом в исследовании патогенеза и разработке методов терапии данного заболевания. В развитии иммунного воспаления при формировании очага псориатического поражения четко прослеживается последовательность реакций: во-первых — повреждение клеточных структур эпидермиса и дермы различными биологическими, химическими и физическими агентами; во-вторых - повышенное продукция кератиноцитами, лимфоцитами, клетками Лангерса воспалительных цитокинов; вазодилатация, повышение сосудистой проницаемости, миграция в кожу клеточных элементов крови; в-третьих - стимуляция клеточной активности эпидермиса (гиперпролиферация кератиноцитов) под влиянием цитокинов, факторов эпидермального и лимфоцитарного происхождения [Griffiths et al., 2003; Gudjonsson et al., 2004; Nickoloff В., 2004; Liu Y., 2007; Sabat et al., 2007].
Прямая роль Т-лимфоцитов в патогенезе псориаза впервые была предположена в 1983г. [Bos J. et al, 1983] и независимо продемонстрировано, что высыпания псориатических бляшек совпадает с притоком дендритных клеток и Т-лимфоцитов [Baker В. et al., 1984]. Положительный терапевтический эффект от применения циклоспорина А в двух независимых исследованиях [Ellis С. et al., 1986; Griffiths С. et al., 1986], анти-СБ4 моноклональных антител [Morel et al., 1992] и интёрлейкин-2-токсина [Gottlieb et al., 1995] послужил доказательством того, что основным патогенетическим звеном иммунного воспаления при псориазе являются Т-лимфоциты. В дальнейшем роль Т-лимфоцитов в псориазе была показана, когда псориатические повреждения индуцировались введением активированных лимфоцитов в непораженные участки псориатической кожи, предварительно пересаженные SCID мышам (мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом) [Wrone-Smite and Nickoloff, 1996]. Более того, псориатические повреждения индуцировались только после введения CD4+ Т-клеток, и напротив, не наблюдались какие-либо изменения после инъекции CD8+ Т-клеток [Nickoloff and Wrone-Smite, 1999].
Согласно одной из гипотез, предложенной учеными из Исландии, в развитии аутоиммунной реакции при псориазе имеет место молекулярная мимикрия - структурное сходство антигенов эпидермальных кератиноцитов с антигенами некоторых патогенных микроорганизмов [Valdimarsson et al., 1997; Gudmundsdottir A., 1999]. В случае псориаза рассматривается гомология пептидной последовательности белка кератина-17 с протеином М стрептококка [Valdimarsson et al., 1997; Gudmundsdottir A., 1999]. Ошибочный симмунный ответ на собственный белок (аутоантиген) в совокупности с другими провоцирующими факторами, возможно, приводит к развитию псориатического фенотипа.
Псориаз относится к группе HLA-зависимых заболеваний. Однако до сих пор неясным остается механизм включения антигенов HLA в- патогенез заболевания [Gudjonsson et al., 2004; Campalani and Barker J.N.W.N., 2005; Cassia et al., 2006]. Предполагается феномен структурного сходства детерминант HLA с антигенами определенных патогенов, в частности вирусов, благодаря чему формируется иммунопатологический процесс в организме.
При аутоиммунных болезнях лимфоциты, запускающие механизмы деструкции, распознают именно нативные молекулы мембран собственных клеток или межклеточного вещества и инициируют иммунное воспаление [Петров Р.В., 1983; Хаитов P.M., 2000; Mackay et al., 2001; Marrack et al., 2001]. При многих болезнях с явными компонентами иммунного воспаления в патогенезе причинные антигены не известны и задействованы разные эффекторные механизмы иммунного воспаления [Хаитов P.M., 2000]. Иммунологами рассматриваются несколько гипотез аутоиммунизации [Петров Р.В., 1983; Mackay et al., 2001; Marrack et al., 2001].
Развитие аутоиммунной реакции при псориазе является сложным многоступенчатым процессом с включением определенных функциональных нарушений, поиск которых представляется возможными методами генетического анализа.
Популяционные, семейные и близнецовые исследования доказывают весомый вклад генетических факторов в развитие псориаза при участии факторов внешней среды [Campalani et al., 2005; Bowcock et al., 2005; Nair et al., 2006]. Так, наиболее ранние работы продемонстрировали относительно высокий риск развития псориаза у родственников больных по сравнению с популяционным значением [Campalani et al., 2005]. Показательной является повышенная 75% конкордантность у монозиготных близнецов и лишь 15-25% -у дизиготных [Campalani et al., 2005]. Характерное для полигенных признаков резкое снижение показателя относительного риска развития заболевания .R-l по мере уменьшения степени родства между родственниками и пробандом указывает на полигенную модель наследования риска развития псориаза [Risch et al., 1990; Rahman P. and Elder J.T., 2005]. В частности, снижение показателя A.R-1 более чем в шесть раз предполагает комплементарную модель взаимодействия генов [Risch et al., 1990].
Выделение геномной ДНК
ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathews, 1984). Кровь набирали в пробирки, в качестве консерванта использовали глюгицир в соотношении 8:2 (кровыглюгицир), тщательно перемешивали и хранили при температуре 4С не более одной недели. Для получения фракции клеточных ядер к 8 мл крови добавляли 40 мл лизирующего буфера (320 мМ сахароза; 5 мМ MgCb; 1% тритон Х-100; 10 мМ трис-HCL, рН=7,6) и центрифугировали 20 мин при температуре 4С и 4000 об./мин. Надосадочную жидкость сливали, к осадку повторно приливали 20 мл лизирующего буфера и центрифугировали при тех же условиях в течение 10 мин. К полученному осадку добавляли 400 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75 мМ NaCl), 40 мкл 10% SDS, 30-40 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубировали при 37С в течение 16 часов. Из полученного лизата выделяли ДНК. Экстракцию ДНК проводили в три этапа: забуференным фенолом (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола-Трис-НО, рН 7,8), смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах. Выделение ДНК проводили, смешивая лизат и растворитель до образования однородной эмульсии, разделение фаз осуществляли центрифугированием при 10000-12000 об./мин. в течение 10 мин. ДНК осаждали двумя объемами 96% этанола. Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали на воздухе, затем растворяли в деионизованной воде и хранили при -20С. Выход ДНК составлял около 50-100 мкг на 1 мл образца крови. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и последующего рестрикционного анализа.
Амплификацию изученных локусов проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе "Терцик" производства компании «ДНК-технология» (г. Москва). Для амплификации использовали реакционную смесь объёмом 25 мкл, которая содержала 2,5 мкл lOxTaq-буфера (67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH S04,, 1,5мМ MgCl2, 0,01% Tween-20), ОД мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP no 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «СилексМ», г. Москва) и 5-10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Перечень исследуемых локусов, последовательности праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов представлены в табл. 2 приложения.
ПЦР проводили по одинаковой схеме: начальная денатурация (95С, 4 мин.); 28 циклов амплификации со следующими параметрами: 1) денатурация - 94С, 40 секунд; 2) отжиг - температура специфичная для каждого локуса (табл. 2), 40 секунд; 3) синтез - 72С, 1 минута; 4) инкубация при 72С в течение 5-10 минут.
Для определения нуклеотидных замен проводили гидролиз амплифицированных фрагментов соответствующей рестриктазой. Данные о полиморфизмах HLA-Cw6 гена HLA-C, HCR-G305A, HCR-C307T, HCR-C325T, HCR477C, HCR-G1723T, HCR-A1911G, HCR-C2327G гена HCR, С1243Т гена CDSN, TNFA-G308A гена TNFA, названия рестриктаз, условия рестрикции и длины продуктов расщепления представлены в табл. 1 приложения. После амплификации 10 мкл амплификата обрабатывали 5 единицами соответствующих рестриктаз в течение 12 часов при соответствующей температуре.
Рестрикцию полиморфных локусов G305A, С307Т, С325Т, G1723T, A1911G, C2327G гена HCR,, С1243Т гена CDSN и G308A гена TNFA проводили эндонуклеазами PstI, Bsh\266l (FnuDll), EcoAll (Avail), Olil, Hhal, HpyFlOYl (MwoT), Hphl, Ncol при температуре 37C. ПДРФ-анализ полиморфного локуса HLA-Cw6 гена HLA-C осуществили эндонуклеазой Smal при температуре 30С, полиморфного локуса HCR477C — эндонуклеазой Tasl (TspEl) при температуре 65С в соответствии с рекомендациями фирм-производителей.
Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции проводили при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном из 30% раствора ПААГ (соотношение акриламид Ы метиленбисакриламид - 29:1). Электрофорез проводили в ІхТБЕ буфере (0,089 М трис-НС1; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН=8,0). Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 15% фикола. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и анализировали при УФ-освещении. Документирование результатов электрофореза проводили с использованием видеосистемы «Geldokulant» (Франция). Результаты электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов исследованных двенадцати полиморфных ДНК-локусов представлены на рис. 1-10 приложения.
Генотипирование с использованием SNPlex платформы (Applied Biosystems)
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Genepop 3.3 [Raymond and Rousset, 1995], «Statistic for Windows 6.0» (StatSoft), программного обеспечения MS Excel 2003 (Microsoft) и компьютерной программы RxC (Rows x Columns) [Roff D., Bentzen P., 1989], оценивающей значимость сравнений при помощи метода Монте-Карло, основанного на использовании многократных повторяющих симуляций, что позволяет не учитывать дальнейшей поправки на множественность сравнений (Sham, Curtis, 1995).
При сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и здоровых доноров применялся критерий %2. Для таблиц сопряженности 2x2 применяли критерий %2 с поправкой Йетса на непрерывность, если частота хотя бы в одной ячейке таблицы была меньше или равно 5, применялся точный критерий Фишера. В случае статистически значимых различий силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов (Odds Ratio, OR), OR l рассматривали как положительную ассоциацию с аллелем или генотипом (фактор повышенного риска) и OR l - как отрицательную ассоциацию (фактор пониженного риска). Все статистические тесты выполнялись для двустороннего уровня значимости, статистически значимыми считали различия при р 0,05, где р - уровень значимости критерия.
Доверительный интервал для относительного риска рассчитывали с помощью программы: http://www.biometrica.tomsk.ru:8100/lib/freq.htm по следующей формуле: OR =exp(lnOR-1.96Vl/a+l/b+l/c+l/d), OR"=exp(lnOR-1.96Vl/a+l/b+l/c+l/d).
Оценку частоты аллелей рассчитывали по формуле: p=(2Ni+N2)/2N, q=(2N3+N2)/2N, где р - частота аллеля A, q - частота аллеля а, N - общий объем выборки N=Ni+N2+N3, где Ni, N2, N3 - численности особей с генотипами АА, Аа и аа, соответственно. Статистическую ошибку оценки частот генотипов рассчитывали по формуле [Л.А. Животовский, 1991]: sp=Vp(l-p)/N, где р - частота генотипа, N - объем выборки Для вычисления статистической ошибки частот аллелей использовали формулу: sp=Vp(l-p)/2N.
Поскольку в наших выборках встречались значения частот р 0,2 и р 0,8, то в таких случаях статистическое распределение ошибки будет асимметричным, поэтому доверительный интервал генерального значения частоты вычисляли по формуле [Л.А. Животовский, 1991]: p =n/[n+(N-n+l)F], р"=(п+1 )F7[N-n+(n+1 )F"], где F — критическое табличное значение .F-распределения с числом степеней свободы v i=2(N-n+l) v 2=2n для уровня значимости а/2. F" -критическое значение F-распределения с v"1=2(n+l) vn2=2(N-n) для того же уровня значимости а/2. Генеральное значение находится в интервале р р р" (Р=1-а).
Для проверки соответствия наблюдаемого распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению по закону Харди-Вайнберга использовался критерий % . При оценке неравновесия по сцеплению каждой пары локусов использовался коэффициент D [Lewontin, 1984], рассчитанный в программе EMLD (https://epi.mdanderson.org/qhuang/Software/pub.htm") и 2LD (Institute of Psychiatry, King s College London, London, UK, http://www.iop.kcl.ac.uk/IoP/ Departments/PsychMed/GEpiBSt/software.shtml). Величины коэффициента D неравновесия по сцеплению были визуализированы графически с помощью программы GOLD [Abecasis and Cookson, 2000].
Для реконструкции гаплотипов и оценки их частот применяли метод Epstein М.Р. и Satten G.A. [Epstein М. and Satten G., 2003], реализованный в программе Chaplin 1.2.2 [Duncan et al., 2006], а также программа Zaykin (http://statgen.ncsu.edu/pub/zaykin/htr/) [Zaykin, 2002].
Для расчета межгенных взаимодействий использовали метод GMDR (Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction), разработанный Lou X.Y. с соав. [Lou X.Y. et al., 2007]. Данный метод позволяет построить оптимальную модель межгенных и ген-средовых взаимодействий на основе анализа качественных и количественных признаков, дихотомических и непрерывных фенотипов и выборок, неодинаковых по числу индивидов [Lou X.Y. et al., 2007]. На основе этой модели с довольно высокой точностью можно предположить о наличии или отсутствии предрасположенности к конкретному заболеванию. Основной характеристикой модели является сбалансированная точность (Balanced Accuracy), которая зависит от чувствительности (Sensitivity, S) и специфичности (Specificity, Sp), рассчитанными по доле верно и неверно классифицированных случаев при многократных перекрестных проверках. Чувствительность и специфичность определяют объективную ценность модели.
Анализ ассоциаций полиморфного локуса Cw6 гена HLA-C с псориазом
Сопоставление с результатами генотипирования локуса HLA-Cw6 зарубежных исследований выявило следующие особенности. Во многих исследованиях выявлены ассоциации различных аллелей локусов HLA с некоторыми хроническими заболеваниями, особенно с теми, в патогенезе которых предполагается аутоиммунная компонента. К таким заболеваниям относятся: анкилозирующий спондилит, при котором антиген HLA-B27 встречается у 90% больных; болезнь Рейтера - антиген HLA-B27 достигает почти 80% у больных при его частоте в популяции 9,4%; псориаз - частота аллеля HLA-Cw6 (известного как HLA-Cw 0602) у больных составляет 54-80%), а в популяциях - 10-20% [Enerback et al.; 1997, Mallon et al., 1997].
Положительные ассоциации аллелей HLA-B13, -В 17, -В57, -В27, -В38, -В39, и -Cw6 класса I и HLA-DR7, -DRB1 и -DOB1 класса II с псориазом были продемонстрированы с начала 70-х годов прошлого века в различных популяциях [Tiilikainen et al., 1980; Asahina et al., 1991; Holm et al., 2003]. Самая значительная ассоциация с псориазом была определена для позитивного аллеля HLA-Cw6 [Tiilikainen et al., 1980; Roitbergamburg et al., 1994; Gonzaga et al., 1996], частота которого у больных составляет 54-80%, а в популяциях — 10-20% [Enerback et al., 1997; Mallon et al., 1997].
Проведенные исследования в Германии [Ahninl et al.,1999], Испании [Gonzales et al.., 2002], Швеции [O Brien et al., 2001], Тайване [Chang et al., 2003; 2005], Китае [Yang et al., 2004; Xing et al., 2008] и США [Helms et al., 2005; Nair et al., 2006] установили достоверную ассоциацию между псориазом и HLA-Cw6. Генотипирование 419 семей и выборок отдельных случаев заболевания из 6 различных популяций выявило увеличение частоты аллеля HLA-Cw6+ среди больных псориазом по сравнению со здоровым контролем [Asumalahti et al., 2002]. Однако ряд других работ в Японии, в Израиле и на Сардинии показал, что HLA-Cw6+ не является аллелем предрасположенности к псориазу в локусе PSORSJ [Oka et al., 1999; Martines-Borra et al., 2005; Orru et al., 2005]. Кроме того, прослеживаются четкие межпопуляционные различия в распределении частот аллеля HLA-Cw6+ у больных псориазом - 10% в Японии, 13,6% на Тайване, 15,6% в Китае, 19,5% в Израиле, 37% в Финляндии, 64,2% в Исландии, 69% в Швеции (рис.12). В нашей работе сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса HLA-Cw у больных псориазом и здоровых доноров русской, татарской, башкирской и хакасской этнической принадлежности продемонстрировал статистически значимые отличия (р 0.05) (табл. 5).
Риск развития псориаза у носителей гомозиготного HLA-Cw6+/Cw6+ генотипа татарской этнической принадлежности оказался выше (OR=6,81; 95%С1 1,8-30,4), чем у больных русской, башкирской и хакасской этнической принадлежности (OR=3,57; OR=3,15; OR=5,64, соответственно). Позитивный аллель HLA-Cw6 превалировал в выборке больных хакаской этнической принадлежности: 57% против 43,6% - у русских, 47,17 - у татар и 54,9% - у башкир (рис.12). Примечательно, что в контрольных группах разной этнической принадлежности практически совпадают величины частот позитивного аллеля HLA-Cw6 у русских и татар (16,1 % и 16,5%, соответственно) с одной стороны, у башкир и хакасов (22,6% и 22%, соответственно) с другой.
Ученые в Исландии установили, что риск развития псориаза у носителей гомозиготного HLA-Cw6+/Cw6+ генотипа выше в 2,5 раза в сравнении с носителями гетерозиготного HLA-Cw6-/Cw6+ [Gudjonsson et al., 2002]. Подобная картина характерна для двух этнических групп из России. У татар (OR=6,81 и OR=4,6; р 0,05, соответственно) и хакасов (OR=5,64 и OR=3,9; р 0,05, соответственно) разница в риске развития между носителями гомозиготного и гетерозиготного генотипов составила 1,5 раза.
При проведении стратификации по клиническим формам псориаза (вульгарный псориаз и псориатическимй артрит), возрасту начала развития псориаза (I тип псориаза - до 40 лет и II тип псориаза - после 40 лет) получены следующие результаты.
Сравнение распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса HLA-Cw6 гена HLA-C у больных вульгарным псориазом и псориатическим артритом и здоровых доноров выявило достоверные отличия (р 0,05) (табл. 6). между двумя группами, OR - отношение шансов, 95%С1 - доверительный интервал.
В обеих группах больных преобладал генотип HLA-Cw6-/Cw6+ с частотой 64,1% у больных вульгарным псориазом и 55,32% - псориатическим артритом. Характерной особенностью является превышение частоты негативного HLA Cw6- аллеля (57,45%) у больных псориатическим артритом над частотой позитивного HLA-Cw6+ (42,55%), сходные результаты отражены в работах ученых из Исландии (80,4% и 58,4%, соответственно) [Gudjonsson et al, 2002,2006]. Обнаружена достоверно значимая ассоциация аллеля HLA-Cw6+ с псориатическим артритом: частота аллеля HLA-Cw6+ у больных превышала в 2 раза по сравнению со здоровыми донорами (OR=3,24; 95%С1 2,32-4,52; р=0,0005). Ассоциативные исследования в Канаде [Rahman et al.,2005], Великобритании [Al-Heresh et al, 2002], Испании [Martinez-Borra et al., 2003], Финляндии [Suomela et al.,2007] продемонстрировали высокую ассоциацию аллеля HLA-Cw6+ с псориатическим артритом. При этом, Китай стал единственным исключением, где отсутствуют подобные результаты [Chang et al., 2007]. Более того, в Испании риск развития заболевания у больных псориатическим артритом оказался выше, чем у больных вульгарным псориазом (OR=6,l и OR=3,6; р 0.05, соответственно) [Martinez-Borra et al., 2003]. Напротив, в нашей выборке и финской популяции [Suomela et al.,2007] у больных вульгарным псориазом, имеющих аллель HLA-Cw6+, риск развития заболевания был выше, чем у больных псориатическим артритом (табл. 6).