Введение к работе
1. Актуальность темы
Целлюлоза является одним из наиболее значительных возобновляемых ресурсов земли, составляет 40Z биомассы планеты и играет важную роль в существовании человечества. Гидролиз целлюлозы для получения глюкозы или олигосахаридов интенсивно исследуется уже более 80 лет. Химический и энзиматический гидролиз, дополняемый иногда механическими методами, являются наиболее часто используемыми методами. Химические методы более эффективны, однако они также более дорогие и вредные для окружающей среды. Стремление использовать энзиматические методы гидролиза вместо химических требует поиска эффективных микроорганизмов „с высокой целлюлазной активностью. Результатом поиска явилось значительное количество выделенных штаммов. Однако успех от применения этих микроорганизмов не был достигнут из-за нерастворимости макромолекул целлюлозы и большого разнообразия целлюлозных комплексов.
Новый интерес к изучению целлюлаз все время возрастает по причине сокращения энергетических, пищевых и кормовых ресурсов и проблем с загрязнением окружающей среды. Использование целлюлаз может помочь в обработке зерна и фруктов, производстве этанола и белка одноклеточных, а также в обработке отходов, что представляет большой экономический интерес.
Целлюлаза является комплексом, состоящим ив трех различно функционируюїдих ферментов, эндо-р-1,4-глюканазн, якао-в-глюканазы и п-глкркозидазы. Для выяснения механизмов ферментативного действия на нерастворимую целлюлозу, исследователями выделено и идентифицированно около восьмидесяти различных природных целлюлаз. Разработанные недавно методы работы с ДНК дают возможность получить отдельные компоненты целлюлосомы, добиться чего при помощи обычных биохимических методов крайне затруднительно. Так, почти 100 целлюлазных генов (включая гены различных коиланая) были клонированы и охарактеризованы на молекулярном уровне, что способствовало пониманию механизмов работы ферментов.
Большое разнообразие целлюлосом требует интенсивного их изучения на базе генетических исследований целлюлаз, входящих в состав комплекса. Относительно изученными являются целлюлосомы из
- -г -
Cellulomuiias f'imi, Clostridium thermocellum, Trichoderma reesei, Ruminococcus albjs, Thermomonospora fusca, Clostriditim cellulovorans, и другие.
Род Місготогющюга, о оольшим разнообразием термостаоильннх целлюлаз, предложен как перспективный микроорганизм для изучения целлгаосом. В соответствии с этим мы начали работу по клонированию генов андонуклеаз из недавно охарактеризованного штамма Шагптоіюзіюга sp. 86W-16, определению их нуклеотлдной последовательности и экспрессии в Fznherinhia cnl1 и StreptnmynRs li vi dans,
Z. Цель и задачи исследования
выделение и изучение нового штамма Mlcromonospora sp. как источника целлюлазных генов;
клонирование целлюлазных генов из Micromonospora sp.;
анализ нуклеотидной последовательности клонированных генов и поиск гомологии с ранее клонированными целлюлазными генами;
предсказание предполагаемых активных участков белков, продуцируемых генами целлюлаз, путем выявления гомологии с другими ферментами;
исследование экспрессии клонированных генов в Є. coli;
исследование экспрессии клонированных генов, интегрированных в хромосому Stretomyces sp.;
использование ДНК клонированных генов в качестве молекулярного зонда для поиска других гомологичных генов в том же и других схожих штаммах.
3. Научная новизна и практическая значимость работы
Более 90 целлюлазных генов были идентифицированы из 41 штамма микроорганизмов, входящих в около 30 родов. В нашей работе впервые в* качестве источника целлюлазных генов использовался штамм Micromonospora cellulolyticum 86W-16. Обнаружена значительная гомология между геном, клонированным в настоящей работе и эндоглшканазой из АМсглЫ.ч/ота bisix>ra. Настоящая работа явилась первой попыткой интеграции гетерологичных целлюлазных генов в хромосому Stretomyces sp. и достижение экспрессии в этом
организме.
Данные нашей работы показали наличие инвертированных повторов в нуклеотиднои последовательности размером 14 п.н. и 6 строго консервативных аминокислотных остатков (некоторые из которых предположительно входят в активные участки фермента), каждые из которых широко встречаются и в других аналогичных ферментах.
Продукт клонированного гена /лселА из М. cellulolyticum 86W-16 является эндоглюканазой молекулярной массы 46 кДа и обладает широким рабочим диапазоном рН и температуры. Поэтому он несомненно может найти промышленное применение в случае достижения сверхэкспрессии гена тсепА.
4. Структура и объем работы