Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1 Причины и особенности экологических рисков в сельском хозяйстве Республики Йемен 9
1.2. Засухоустойчивость пшеницы как проявление неспецифической адаптации к природным стрессовым факторам13
1.3. Дефицит влаги как лимитирующий фактор, меняющий уровень физиологических процессов растений пшеницы 17
1.4 Особенности функционирования защитных механизмов растений при стрессовом воздействии на них дефицита влаги 21
1.5 Генетическая система гибридов аллоцитоплазматической пшеницы как отражение комплементарного характера взаимодействия ядерной
и внеядерной генетических систем 26
1.6 Внутрипопуляционная изменчивость как источник
формообразовательных процессов у пшеницы мягкой T.aestivum L 30
1.7. Влияние глютенинов на хлебопекарные качества пшеницы 35
1.8. Принципы и методы создания аллоцитоплазматической пшеницы T.aestivum L . 39
ГЛАВА 2. Объект и методы исследований . 41
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 43
3.1 Морфобиологическое разнообразие генотипов АЦПГ в исходной гибридной популяции в условиях стрессовых воздействий засухи 2010 г в период формирования и налива зерновок пшеницы (IX-XI этапы органогенеза) 43 3.2. Сравнительная характеристика линий и гибридов АЦПГ по элементам продуктивности в условиях засухи 2010 года и в условиях достаточного увлажнения (2008 и 2009 гг.) 56
3.3. Специфика реакции изучаемых генотипов АЦПГ, отобранных в 2010г, на стрессовое воздействие засухи (2011г) в период формирования вегетативной массы растений (II -VII этапы органогенеза) 60
3.4. Анализ аллельного состава генов, связанных с хлебопекарными качествами, у аллоцитоплазматических гибридов пшеницы 65 3.4.1. Скрининг аллельного состава генов, связанных с
хлебопекарными качествами зерна у гибридных популяций АЦПГ 66
3.5. Скрининг одиннадцати линий АЦПГ, созданных на основе отбора в 2010г продуктивных колосьев, и анализа аллельного состояния высокомолекулярных глютенинов методом ПЦР 68
3.5.1. I группа – исходная популяция с цитоплазмой T.timopheevi 70
3.5.2. II группа – исходная популяция: АЦПГ T.timopheevi SV66342 х оз. сорт Заря, F1 (№ 2д/04) 72
3.5.3. III группа – исходная популяция с цитоплазмой Secale cerealе.. 75
3.5.4. IV группа - исходная популяция с цитоплазмой Secale cerealе. 77
3.5.5. V группа –популяция АЦПГ с цитоплазмой пшеницы мягкой T.aestivum L 78
Заключение 81
Выводы 83
Список сокращений 85
Список литературы 86
Приложения 1-9 92
- Засухоустойчивость пшеницы как проявление неспецифической адаптации к природным стрессовым факторам
- Принципы и методы создания аллоцитоплазматической пшеницы T.aestivum L .
- Специфика реакции изучаемых генотипов АЦПГ, отобранных в 2010г, на стрессовое воздействие засухи (2011г) в период формирования вегетативной массы растений (II -VII этапы органогенеза)
- Скрининг одиннадцати линий АЦПГ, созданных на основе отбора в 2010г продуктивных колосьев, и анализа аллельного состояния высокомолекулярных глютенинов методом ПЦР
Засухоустойчивость пшеницы как проявление неспецифической адаптации к природным стрессовым факторам
Известно, что в аридных регионах доминируют такие лимитирующие факторы развития растений, как дефицит влаги, избыточная инсоляция и процессы прогрессирующего засоления почв. В связи с этим возрастает актуальность изучения механизма биологической адаптации живых организмов на различных уровнях их организации и ступенях развития. С генетической точки зрения устойчивость - полигенный признак, находящийся, вероятнее всего, под контролем не просто нескольких геномов, а всего генотипа растения в целом [9, 10].
В настоящее время усилия ученых направлены на полную расшифровку механизмов стресса на молекулярном и клеточном уровнях. Особый интерес вызывают данные об активации в условиях стресса в клетках синтеза так называемых стрессовых белков с одновременным ослаблением синтеза белков, образующихся в нормальных условиях. Кроме синтеза шоковых белков, показывающего, что в геноме записана специальная программа, связанная с переживанием стресса, при неблагоприятных обстоятельствах в клетках возрастает содержание углеводов, пролина, которые участвуют в защитных реакциях, стабилизируя цитоплазму. При водном дефиците и засолении у ряда растений концентрация пролина в цитоплазме возрастает в 100 раз и более. Благодаря своим гидрофильным группам пролин может образовывать агрегаты, которые ведут себя как гидрофильные коллоиды. Этим объясняется высокая растворимость пролина, а также способность его связываться с поверхностными гидрофильными остатками белков. Необычный характер взаимодействия агрегатов пролина с белками повышает растворимость белков и защищает их от денатурации. Накопление пролина как активного осмотического вещества благоприятствует удержанию воды в клетке [30].
Продолжительность периода репарации после стресса тем больше, чем выше напряженность экстремального фактора, и чем ниже уровень устойчивости к нему растения. Первоначальное, слабое по силе экстремальное воздействие делает организм устойчивым к более сильной стрессовой нагрузке. При этом оказалось, что устойчивость к стрессовому воздействию повышает предварительная обработка (закалка) растений не только тем же, но и другими типами экстремальных факторов. Наиболее чувствительным к стрессам является период с повышенной синтетической активностью.
В экстремальных условиях образование боковых побегов резко подавляется, а при пороговом уровне стресса полностью блокируется, и у растений развивается лишь один главный побег. Боковые побеги отличаются от главного значительно большей чувствительностью к неблагоприятным внешним воздействиям. Сохраняя в таких условиях лишь главный побег, организм создает условия для образования полноценных семян, хотя и в ограниченном количестве. Для сохранения вида как биологической единицы это важнее, чем образование большого количества неполноценных семян с пониженной жизнеспособностью. При продолжительном отклонении погодных условий от оптимальных депрессии в первую очередь подвергается тот элемент структуры урожая, формирование которого совпало с периодом действия стресса [30].
Понятие неспецифичности адаптации растений к различным неблагоприятным факторам среды имеет важное значение при изучении устойчивости растений к какому-либо одному виду стресса для раскрытия механизмов адаптации растений к другим стрессам, а также для более детального выяснения общей природы устойчивости растений и разработки общих принципов ее повышения [10].
В многолетних исследованиях коллекции растительных ресурсов ВИРа по единой программе получены данные по реакции растений на засуху, засоление, высокие и низкие температуры. Результаты исследований характера изменения под влиянием этих стрессов большого числа физиологических, биохимических, биофизических, морфолого-анатомических и ультраструктурных параметров у разных по стрессовой устойчивости видов и сортов растений в обобщенном виде представлены в таблице 2.
Наличие такого однообразия конечного эффекта при воздействии на растение качественно разных стрессовых факторов является следствием поливариантности путей развертывания и реализации программы онтогенетического развития растительного организма, нивелирующей возможные специфические отклонения промежуточных звеньев этой программы.
Характерной особенностью адаптации растений, например, к засухе и засолению является резкое возрастание в них осмотического потенциала, но при засухе за счет повышения в клетках концентрации органических соединений, а при засолении — путем аккумуляции ионов солей из внешней среды [14].
Принципы и методы создания аллоцитоплазматической пшеницы T.aestivum L .
Первоначальные исследования, связанные с использованием различных видов Aegilops и Triticum, были направлены на решение проблемы гибридной пшеницы, для создания генетической системы, включающей стерильные растения (материнские формы с ЦМС) и восстановители фертильности (отцовские формы-опылители, несущие ген Rf). Из большого числа изученных видов — потенциальных доноров чужеродной цитоплазмы наиболее приемлемой оказалась цитоплазма T.timopheevi, у которой отсутствуют нежелательные побочные фенотипические признаки и свойства. Поэтому с этим типом цитоплазмы были связаны наиболее широкие исследования как в генетическом, так и в селекционном плане. Исследования были направлены на создание и изучение явления ЦМС и восстановителей фертильности [22, 23].
Параллельно исследования шли в двух направлениях: по созданию стерильных аналогов и по созданию восстановителей фертильности.
При создании восстановителей особую ценность представляли ранние беккроссы от скрещивания T.timopheevi с мягкими пшеницами (рис. 1.). В процессе создания стерильных аналогов при насыщающих скрещиваниях доноров чужеродной цитоплазмы культурным сортом пшеницы проводили отбор растений со стерильной пыльцой (ЦМС), а также растений, фертильных по пыльце. Таким образом, отбор проводили одновременно в двух противоположных направлениях — на стерильность (А) и на самофертильность (R). Отбор вели по признакам культурного сорта.
Дальнейшая работа заключалась в получении гибридов F1 от скрещивания отдельных (индивидуальных) стерильных растений с цитоплазмой T.timopheevi с индивидуальными растениями-восстановителями фертильности с одновременной их проверкой на самофертильность при изоляции. Найденные индивидуальным методом изучения лучшие растения-восстановители фертильности впоследствии были размножены. Путем отбора наиболее продуктивных колосьев в течение ряда поколений с одновременным индивидуальным отбором по комплексу признаков были созданы константные самофертильные формы аллоцитоплазматической пшеницы, используемые для создания различных гибридных комбинаций [29]. Объектом исследования являлись 36 генотипов аллоцитоплазматических гибридов яровой мягкой пшеницы из коллекции аграрного факультета РУДН.
Пятнадцать образцов имели цитоплазму Triticum timopheevi, из них тринадцать – гибриды с яровыми сортами пшеницы, восемь образцов – гибриды с озимыми сортами Заря и Московская 39.
Шестнадцать образцов имели цитоплазму Secale cereale L., из них шесть – гибриды с озимыми сортами.
На цитоплазме Aegilops ovatа была представлена одна линия АЦПГ. Четыре генотипа пщеницы - с цитоплазмой Triticum aestivum L. (получены в результате обратных скрещиваний).
Методика проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР)
В работе было проведено изучение коллекции 36 аллоцитоплазматических генотипов мягкой пшеницы на аллельное состояние высокомолекулярных глютенинов локуса Glu-D методом полимеразной цепной реакции.
Наличие локуса высокомолекулярного глютенина с комбинацией субъединиц 5+10 или 2+12 определялось с помощью прамеров: Dx5F, DxF, DxR.
Морфобиологическая идентификация генотипов АЦПГ
Морфологические признаки: тип куста у развитых растений и их высота; окраска листовой пластинки; степень облиственности растений; площадь флаговых и предфлаговых листьев; характер стебля (толщина и гибкость); положение и форма колоса; размеры колоса (длина, ширина) и его плотность; остистость (степень) и окраска колоса; форма зерновки, ее размеры и окраска; структура эндосперма; форма бороздки. Биологические особенности: быстрота роста от всходов до колошения и от колошения до полного созревания; фенология – продолжительность различных периодов вегетации; степень устойчивости к полеганию.
Экспериментальные посевы проводились на Полевой станции МСХА им К.А. Тимирязева в период с 2009г по 2012г в коллекционном питомнике АЦПГ. Опыты включали ручные и сеялочные посевы (площадь сеялочных посевов 5 м2 с нормой высева 5.5 млн. зерновок на га).
Оценка хозяйственно-важных признаков включала: определение продуктивности колоса (растений) и других элементов продуктивности в соответствии с общепринятыми методиками.
Специфика реакции изучаемых генотипов АЦПГ, отобранных в 2010г, на стрессовое воздействие засухи (2011г) в период формирования вегетативной массы растений (II -VII этапы органогенеза)
Специфика погодных условий 2011г заключалась в том, что дефицит влаги в процессе роста и развития растений совпал с периодом формирования их биомассы (IV-VII этапы органогенеза) в отличие от 2010г, когда засуха была в период налива зерна. Летний период вегетации 2011г, как известно, был также сухим и жарким (рис.7). В мае 2011г в московском регионе отмечен 50% дефицит осадков, что в совокупности с превышением температурной нормы на 1,5С обусловило начало атмосферной засухи, которая в дальнейшем трансформировалась в почвенную. Июнь 2011г также оказался теплее и засушливее июня 2010г. Средняя температура июня составила 19С, что на 2,4 выше климатической нормы, а осадков в июне 2011г выпало всего лишь 38 мм, что составило 50% месячной нормы (75мм). В программу работы входило сравнительное изучение засухоустойчивости одиннадцати генотипов (линий) яровых форм АЦПГ различающихся типами цитоплазмы (T.timopheevi, S.cereale и генотип с цитоплазмой T.aestivum L.). Для создания этих линий были отобраны самые крупные колосья из восьми наиболее продуктивных популяций, средняя масса зерна с колоса у которых в 2010г была не ниже 1.0 г.
Кроме того, для создания линий в эту группу (№ 8/11) были дополнительно включены наиболее крупные колосья еще из трех популяций, масса зерна с колоса у которых имела средние значения: 1,2г; 1,0г и 1,8г. Таким образом, общее число высеянных колосьев составило одиннадцать штук с одновременной их проверкой с использованием молекулярных маркеров (табл.8).
Индивидуальный посев отобранных колосьев был проведен с одновременным отбором из каждого колоса по 15 зерновок для анализа аллельного состояния высокомолекулярных глютенинов методом ПЦР, что в значительной степени определило целевое направление отбора на качество клейковины, как важнейшей составляющей характеристики технологических свойств зерна.
Как видно из таблицы 8 среди одиннадцати создаваемых линий пять генотипов оказались на цитоплазме T.timopheevi, среди которых четыре генотипа – это гибриды с озимым сортом Заря (F7 – F8), три генотипа имеют цитоплазму S.cereale, один из которых – гибрид с озимым сортом Заря.
Три генотипа – с обычной пшеничной цитоплазмой (T.aestivum L.) поскольку они были получены в результате обратного скрещивания, в котором за материнскую форму в предыдущих скрещиваниях был взят яровой сорт пшеницы мягкой (T.aestivum L.).
Подробный анализ истории происхождения отобранных генотипов в предшествующих поколениях популяций позволил уточнить характер формирования популяций и установить для некоторых из них единое происхождение, что было использовано для дальнейшего исследования специфики формирования генетического разнообразия популяций. В связи с этим дальнейший генетический и морфологический анализ был проведен также и в 2012 г с учетом особенностей формирования популяции. Так, оказалось, что единое происхождение имеют две линии с цитоплазмой T.timopheevi - №№ 8-8/12 и 8-6/12.
Три линии (№№ 8-2/12; 8-5/12; 8-4/12) также имеют цитоплазму T.timopheevi. Отличие их от первых двух линий заключается в том, что это гибриды с озимым сортом Заря. Особый интерес представляют две линии (8-1/12 и 8-11/12) поскольку у них один тип уникальной цитоплазмы S.cereale L., однако, они различаются по компонентам скрещивания. В частности, линия 8-1/12 – гибрид с сортом Саратовская 29 (1996г), а линия 8-11/12 – гибрид полученный от скрещивания с сортом Энита, а позднее (2003г) с озимым сортом Заря. Тот же тип чужеродной цитоплазмы (S.cereale) имеет линия, созданная на основе отбора из гибридной популяции, полученной в результате гибридизации АЦПГ Саратовская 29 (л.92) с цитоплазмой S.cereale с сортом Safed Lerma в 1991г. Наконец, пятая группа включает три линии (8-10/12; 8-9/12; 8-3/12), полученные на основе гибридизации, с цитоплазмой обычной пшеницы T.aestivum L. в результате обратного скрещивания АЦПГ T.timopheevi с яровым сортом Cosir, который был взят в качестве материнского компонента скрещиваний в 1988г. Изучаемые генотипы АЦПГ характеризуются рядом морфобиологических особенностей. Пять изучаемых форм – это гибриды аллоцитоплазматической пшеницы c озимым сортом Заря (F8). Сорт Заря, использованный при гибридизации в качестве отцовской формы, отличается крупнозерностью и устойчивостью к некоторым грибным патогенам, что и определило целесообразность использования его для гибридизации с яровыми формами АЦПГ. Возможности реализации генетической программы развития изучаемых форм АЦПГ в условиях весеннее-летнего дефицита влаги и высоких температур 2011г оказались весьма ограниченными, особенно в вегетативной фазе развития растений, когда формируются листовые зачатки и вегетативные пазушные почки. Это значительно ограничило морфобиологические процессы растений, о чем свидетельствует соотношение площадей флаговых и предфлаговых листьев (прил. 9, рис.1.9). Средняя площадь флаговых листьев составила 6,8см2 (амплитуда колебаний 5,0 -10,3 см2), тогда как средняя площадь предфлаговых листьев у изучаемых генотипов составила 9,9 см2 (амплитуда колебаний 7,4–12,2 см2). При этом у большинства позднеспелых генотипов снижение площади листьев оказалось значительно больше, чем у среднеспелых генотипов. Это объясняется тем, что неблагоприятные условия развития в значительно большей степени ограничили возможности ростовых процессов у позднеспелых сортов.
Неравномерное распределение осадков в период налива зерна (колошение растений 14-16 июня) также отрицательно сказалось и на процессах налива зерна, и его крупности. Средняя масса 1000 зерен у изучаемых генотипов составила 33,4г (амплитуда колебаний - от 29,0г до 42г.).
В условиях 2011 отмечено свойство саморегулирования процесса формирования элементов продуктивности, которое проявилось в форме явления «компенсации элементов продуктивности», когда у генотипов с меньшим количеством зерновок их крупность увеличивается. В варианте №11 (АЦПГ Secale cerealе х озимый сорт Заря – F7) масса тысячи семян была наибольшей (42г) при наименьшем числе зерновок в колосе (26,4 шт). В варианте №10 (АЦПГ T.timopheevi, линия) средняя продуктивность колоса была на том же уровне, как и в варианте №11. Однако, соотношение элементов продуктивности имело иной характер: число зерновок в колосе было на 10 шт. больше (37 зерновок), но их крупность (масса 1000 зерновок, г) на 10г меньше, т.е. 32 г.
Полученные результаты позволили отметить следующие генотипы пшеницы АЦПГ, отличающиеся более высокой стресс-толерантностью к дефициту влаги в период II-VII этапов органогенеза. Для дальнейшего размножения были выделены следующие формы АЦПГ:
Скрининг одиннадцати линий АЦПГ, созданных на основе отбора в 2010г продуктивных колосьев, и анализа аллельного состояния высокомолекулярных глютенинов методом ПЦР
Итоговый скрининг одиннадцати линий АЦПГ (группа № 8 в 2012г) анализа аллельного состояния высокомолекулярных глютенинов методом ПЦР представлен в таблице 11, включающей также результаты анализа количества клейковины и ее качества (седиментация и ИДК). Морфобиологическая характеристика всех одиннадцати генотипов, включающая ряд характеристик, представлены в приложении:
особенности формирования элементов продуктивности в различных погодных условиях 2010-2012гг (прил. 4; табл. 4-1; 4-2);
особенности формирования ассимиляционной площади листьев (флаговый и предфлаговый) в зависимости от действия лимитирующих факторов (засуха) в 2011 и 2012гг (прил. 5, табл. 5-1);
некоторые отличительные морфологические особенности растений АЦПГ (группа № 8), у вновь созданных линий, полученных путем посева отдельных колосьев, отобранных в 20 10г (прил. 6, табл. 6-1);
особенности формирования вегетативной массы растений у одиннадцати линий АЦПГ (группа № 8), в период «всходы-колошение» (2011 и 2012гг) в сравнении с исходными популяциями, в которых сделаны отборы растений (2010г) (прил. 7, табл. 7-1).
Дальнейшее изучение созданных линий осуществлено с учетом особенностей происхождения исходных гибридных популяций, в связи с чем все изучаемые 11 линий разбиты на пять групп.
Морфобиологический полиморфизм двух популяций АЦПГ (№№ 8-8/12 и 8-6/12), имеющих один тип цитоплазмы (T.timopheevi), единый источник (18/01) и одинаковый тип аллеля (рис. 8), который экспрессирует субъединицу 5+10, проявился в значительных различиях по содержанию клейковины: № 8-6/12 – 24.5% (хороший филлер) и № 8-8/12 – 30.9% (сильная пшеница, хороший улучшитель).
В то же время качество клейковины у обоих генотипов весьма хорошее, о чем свидетельствуют показатели седиментации у №8-6/12 – 43мл (сильная) и показатели ИДК у № 8-8/12 – 69.4 ед. (1-я группа качества). Отмечены также некоторые различия по темпам развития ростовых процессов. Так, генотип № 8-6/12отличается от генотипа № 8-8/12 более низкими темпами ростовых процессов и темнозеленой окраской листьев. Очевидно, отмеченные особенности развития нашли отражение в показателях селекционных индексов, которые в большинстве случаев у генотипа № 8-6/12 выше по сравнению с генотипом № 8-8/12: индекс продуктивности, линейной плотности колоса, потенциальной продуктивности колоса, канадский индекс и индекс микрораспределений (прил. 8, табл. 8.1).Итак, сравнение двух линий, полученных в результате индивидуального отбора из общей популяции свидетельствует об их сходстве по таким качественным характеристикам, как принадлежность к одной разновидности и качество клейковины. В то же время отмечены различия по некоторым морфологическим и биологическим признакам таким, как темпы роста и развития растений, формирование ассимиляционной поверхности листьев (флагового и предфлагового), а также по показателям селекционных индексов (табл.12). В процессе расщепления из гибридной популяции (F4) были выделены генотипы двух разновидностей – Лютесценс и Эритроспермум. В дальнейшем в седьмом гибридном поколении (2010г) были отобраны продуктивные колосья, которые после анализа аллельного состояния высокомолекулярных глютенинов методом ПЦР были высеяны отдельно по колосу в 2011г для создания линий.
Анализ методом ПЦР отразил генетическое разнообразие создаваемых линий, проявившись в том, что два генотипа имели гомозиготный характер; при этом у одного генотипа (№ 8-8/12) гомозиготность была по аллелю, экспрессирующему субъединицу 5+10, тогда как у второго (№ 8-2/12) – в альтернативной комбинации 2+12. У третьего генотипа было установлено наличие как субъединицы 5+10 высокомолекулярных глютенинов, так и альтернативной аллели 2+12 (т.е. гетерозиготное состояние). Оказалось, что по содержанию клейковины все три генотипа относятся к сильным пшеницам: № 8-2/12 -30,5%; № 8-4/12 - 30.3% (хороший улучшитель); № 8-5/12-28.0% (удовлетворительный улучшитель). Анализ качества клейковины методом седиментации определил принадлежность всех трех генотипов к сильным пшеницам (36мл - № 8-2/12; 40мл - № 8-4/12; 43мл - № 8-5/12). Для всех трех генотипов характерен замедленный уровень начального роста растений с одновременным формированием широких листьев, темно-зеленой окраски (табл. 13). Следует отметить, что это свойство (мощное формирование листовой поверхности) проявляется в погодных условиях, обеспечивающих необходимое количество влаги в период II-VIII этапов органогенеза (до колошения), как, например, в 2012г (рис 10).
