Введение к работе
Актуальность іемьі. Одно из перспективных направлений
^технологического использования дрожжей - получение кормового и
пкиевого белка из дрожжевых клеток. Необходимость получения
~ белка из одноклеточных микроорганизмов вызвана недостаточным
эдержанием белка и некоторых незаменимых аминокислот в растительных зрмах. Способность ряда дрожжей усваивать непищевое сырье (гидролизаты эевесины.метанол, этанол, углеводороды) и высокое содержание белка в іомассе (от 45 до 60%) обуславливает перспективность использования их
качестве продуцентов микробного белка. Дрожжи Candida utills :пользуют для промышленного получения кормового и пищевого белка на ганоле. В нашей стране освоено производство кормового белка "Эприна" і основе этанола. В качестве продуцента в этом процессе используют рожжи С. utili3, которые характеризуются высоким выходом биомассы при зсте на этаноле (70 - 75). и высоким (до 55) содержанием белка в домассе.
Ценность белка в большой степени зависит от содержания незаминимых шнокислот, самой дефицитной из которых является лизин. Один из эзможных путей повышения содержания лизина в дрожжевом белке эздание мутантов, обладающих способностью к сверхсинтезу лизина. Для элучения продуцентов лизина у дрожжей используют методы селекции згуляторных мутантов с нарушенным механизмом ретроингибирования юсинтеза аминокислоты конечным продуктом. К повышенному биосинтезу лзина приводят также мутации, блокирующие катаболизм лизина на ранних гапах. Такие мутанты - продуценты лизина были получены для ряда рожжей: Saccharomyces cerevisiae, Candida pelliculosa, Yarrowia Lpolytica и др..
Цели и -задачи работы. Целью данной работы являлось получение у эомышленных штаммов этанолусваивахщих дрожжей Candida utilis мутантов,
способных к повышенному биосинтезу лизина. Для достижения этой uej были поставлены следующие задачи:
1. Изучение селективных условий для получения мутантов С. utilis
устойчивых к структурному аналогу лизина, Б-(2-аминозтил)-Іі-цистет
(АЭЦ).
2. Получение и анализ АЭЦ-устойчивых мутантов с повышеннь
содержанием лизина.
3.Получение мутантов с нарушенным катаболизмом лизина.
4. Получение и анализ мутаций АЭЦ-устойчивости у мутантов
нарушенным катаболизмом лизина.
5. Изучение технологических свойств наиболее продуктивных по ЛИЗИ)
мутантов в условиях непрерывного культивирования.
Научная новизна работы Для промышленных штаммов С. utilis ВСБ-651 УФА-2 получена коллекция спонтанных и индуцированных стабильщ мутантов, устойчивых к S-2-аминозтил-Ь-цистеину, с повышенным t сравнению с родительскими штаммами уровнем биосинтеза лизинг содержащих в пуле свободных аминокислот до 20-40 мг лизина в рассче-на 1 г сухой биомассы, что в 10-20 раз превосходит содержат свободного лизина в пуле родительских штаммов. У штамма ВСБ-*! получены стабильные мутанты с нарушенным катаболизмом лизина (Lye-), результате поэтапной селекции на основе Lyc-мутантов получены культурі несущие одновременно мутации нарушения катаболизма лизина устойчивости к аналогу. Показано положительное влияние мутации і катаболизму лизина на уровень внутриклеточного свободного лизина аналогорезистентных мутантов. Двойные мутанты накапливали в клеточні пуле до 40-60 мг лизина в рассчете на 1 г сухой биомассы, что в 20-; раз выше уровня свободного лизина у родительских штаммов. Повышен) уровня свободного лизина у мутантов приводило к повышению суммарного
содержания лизина в биомассе и клеточном белке. У мутантов содержание лизина в клеточном белке составляет 11,0-14,4%, при 7,8-8,5% яизина в белке у родительских штаммов.
Практическая ценность работы. Полученные у мутантов С. utilis соличества лизина в клеточном белке полностью снимают имеющийся в іастоящее время дефицит лизина в клеточном белке заводских продуцентов. Сорошие результаты по сохранению селектируемого признака, ростовых сарактеристик и конкурентоспособность при непрерывном культивировании в гтеридьных и нестерильных условиях на Ферментерах "БиоФло", показанные [ри анализе одного из мутантов, свидетельствуют о потенциальной юзможности использования таких мутантов в промышленном производстве. Апробация результатов И. публикации. Результаты настоящей работы окладывалиеь на межлабораторных семинарах ВНИИ генетики.
Основные материалы диссертации опубликованы в двух печатных работах, аявке на патент RU N 93019585 (подана 15 мая 1993г.)
Структура и объем работы, Дисертация состоит из следующих разделов: ведение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований их обсуждение, список литературы. Работа проиллюстрирована рисунками таблицами.