Введение к работе
І. 1.1. Актуальность темы диссертации. Изучение структурных и функциональных изменений генома в популяциях соматических и репродуктивных клеток представляет несомненный интерес для всесторонней оценки генетической стабильности организмов как в тест-системах in vitro, так и в условиях in vivo. Геном эукариотических организмов локализован, главным образом, в клеточном ядре. Морфология и структура клеточного ядра во многом отражает функциональное состояние клетки и воздействие разнообразных факторов (внутренней или внешней природы) на клетку, которая является одним из основных элементов клеточной популяции, может быть охарактеризовано по определённым морфофункциональным маркерам интерфазного генома. Так, к настоящему времени, методы интерфазной цитогенетики являются неотъемлемой частью подходов для оценки стабильности эукариотического генома, а в ряде случаев, когда необходимо провести экспресс-анализ частоты нарушений генома, дают больше преимуществ по сравнению с классическим метафазным методом (Ильинских и др., 2005). Достоверно установлено, что хромосомные аберрации дицентрического типа могут влиять и изменять морфологию интерфазных ядер, приводя к формированию клеток с мостами (Алов, 1972; Gisselsson, 2000). Интерфазные мосты в клетках формируются из полицентрических хромосом и свидетельствуют о структурных аберрациях хромосом (Бочков и др., 1972). Циклы "разрыв хромосом - слияние фрагментов — образование хромосомного моста" могут длительное время воспроизводиться в ряду клеточных поколений (McClintock, 1942; Прокофъева-Бельговская, 1961; Gisselsson, 2000) и обусловливать кариотипическую гетерогенность клеточных популяций (Оленов, 1967; Олиници, 1982). Поскольку в злокачественных опухолях наблюдаются повышенные спонтанные частоты хромосомных аберраций, в том числе в дицентрического типа (Dijkhuizen et al., 1995; Mondelo et al., 1995), то для получения достоверных значений частот клеток с микроядрами и интерфазными мостами в клонах злокачественных клеток можно обходиться незначительным количеством клеточного материала. Не требует процедура определения частоты клеток с интерфазными мостами и значительных затрат времени. Таким образом, не прибегая к хромосомному анализу по морфологии ядра интерфазной клетки можно с высокой эффективностью определять частоты структурных хромосомных аберраций дицентрического типа в клеточных популяциях in vivo (Кравцов и др., 1997). По этим причинам представляется возможным и перспективным клоналышй анализ и
искусственный отбор по признакам "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с интерфазными мостами" в клеточных популяциях перевивных опухолей. При этом отбор проводится в больших выборках клонов, каждый из которых состоит из ограниченного числа клеток (Кравцов и др., 1990). Важно отметить, что методы интерфазной цитогенетики, в отличие от классического цитогенетического анализа, позволяют привлечь к анализу по искомому признаку большинство клеток данной клеточной популяции, что с успехом используется в генотоксикологии (Ильинских и др., 2005). Повышенная частота микроядер, как
-правило, отражает нестабильность зукариотического генома, что позволяет использовать этот параметр для широкомасштабного мониторинга популяций в условиях с меняющимся техногенным
. давлением (Fenech et al., 1997). Сказанное особенно актуально для экотоксикологического мониторинга рыбных ресурсов, когда необходимо оценить антропогенное воздействие на большой выборке рыб (Hyinskikh et al.,1998).
В настоящее время не вызывает сомнения, что формирующаяся генетическая нестабильность, ведет не только к новообразованиям, но может быть также ответственна и за ряд ее отдалённых феноменов, реализующиеся на организменном уровне. Полагают, что одним из ведущих факторов в возникновении нестабильности генома является оксидативный клеточный стресс, следствием которого являются ошибки в период репарационного восстановления ДНК - молекулы, ответственной за передачу наследственной информации. Ионизирующая радиация, химические мутагены, биологические агенты (вирусы), а также излучения неионизирующей природы, способны вызывать изменения генетического материала. В связи с этим возникает необходимость в дальнейшем развитии подходов, основанных на принципе анализа отдельных интерфазных клеток с возможностью учёта повреждений в молекуле ДНК. Микроэлектрофорез ДНК одиночных клеток, как показывают недавние работы, позволяет выявлять не только двунитиевые разрывы, но и щёлочелабильные основания ДНК, которые при определённых условиях трансформируются в однонитиевые разрывы (Collins, 2004).
Мутационное (генотоксическое) воздействие на эукариотический геном проявляется, как правило, постепенно и
1 является многостадийным процессом, реализующимся через
процессы транскрипции и трансляции. При этом число
ядрышкообразующих районов хромосом и их морфометрические характеристики, как свидетельствуют многочисленные работы, могут являться важным показателем функциональной активности
клетки (Mamaev, Mamaeva, 1990; Juntos, Pogacnik, 2000). Доказана прямая зависимость числа рибосомных цистронов от пролиферативного статуса клеток, направления их дифференцировки и степени полишюидизации ядра (Crocker, 1999). Существуют убедительные доказательства того, что вирусы способны взаимодействовать с ядрышкоформирующими белками или используя их как "челнок", или непосредственно модифицируя функционирование интерфазного ядрышка клетки (Kalland et al., 1994). Большое значение в синтезе белков клетки играют рибосомные гены, являющиеся структурными элементами ядрышек и ядрышковых организаторов, что привлекает внимание экологов к использованию характеристик этих структур (Ilyinskikh et al., 1998; Arkhipchuk, Garaoko, 2005).
В своих исследованиях мы использовали надёжно апробированные методы, позволяющие объективно оценивать на основе морфофункциональных характеристик элементов клетки степень нестабильности генома.
1.2. Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось обоснование использования нарушений морфологии ядра, как интерфазных маркеров в оценке разнохарактерного влияния дестабилизирующих геном факторов и селекционного давления на клеточные популяции.
При этом были поставлены следующие задачи: -доказать на основе использования перевивной органотропной рабдомиосаркомы РА-23 крыс возможность получения клонов клеток с повышенными и пониженными частотами нарушений морфологии ядра по типу "интерфазные мосты"; -провести сравнительную характеристику кариотипической изменчивости в полученных клонах клеток с повышенными и пониженными частотами нарушений морфологии ядра по типу "интерфазные мосты";
-выявить, что в клеточных популяциях такие нарушения морфологии ядра, как "интерфазные мосты" и "хвостатые ядра", взаимообусловлены;
оценить клеточный состав костного мозга и периферической крови крыс, подвергшихся облучению электромагнитными волнами гектагерцового диапазона;
определить фоновые показатели нарушений морфологии ядер клеток крови .у хозяйственно значимых видов рыб Каспийского бассейна;
-оценить дестабилизирующее воздействие на геном
низкоэнергетического переменного магнитного поля и лазерного
облучения с применением микроядерного теста и
микроэлектрофореза ДНК одиночных клеток;
-оценить in vivo комбинированное воздействие
низкоэнергетического переменного магнитного поля и лазерного
облучения на концентрацию стволовых клеток в костном мозге
мыши;
-доказать возможность использования метода
микроэлектрофореза ДНК одиночных клеток для выявления
сперматозоидов быков с нестабильным геномом;
- оценить частоту и провести кариоморфометрический анализ
интерфазных ядрышковых организаторов in vivo у животных под
воздействием различных факторов;
-исследовать функциональное состояние in vivo лимфоцитов
периферической крови коров положительных и отрицательных в
РИД с использованием иммуноцитохимического анализа на
ядерный антиген пролиферации клеток.
13. Научная новизна. Впервые обосновано использование комплекса информативных показателей особенностей морфологии ядра для оценки нестабильности генома животных. Выявлена положительная корреляция между образованием мостов в ала- и телофазе, формированием клеток с интерфазными мостами и возникновением клеток с «хвостатыми» ядрами и микроядрами в популяциях соматических клеток.
Впервые на основе наследственной гетерогенности клонов перевивных опухолевых клеток in vivo по признаку "частота клеток с интерфазными мостами" и разработанной методики отбора на повышение и снижение частоты встречаемости клеток с интерфазными мостами доказана возможность направленного получения популяций клонов клеток с низкой и высокой дестабилизацией генома.
Установлено, что персистенция в клеточной популяции в ряду нескольких клеточных поколений высоких частот клеток с нарушенной морфологией ядра по типу "интерфазные мосты'' приводит к резкому снижению жизнеспособности клеточной популяции.
Установлено, что анализ морфологических нарушений ядер клеток крови ценных видов рыб Каспийского бассейна является надёжным инструментом для контроля антропогенного влияния на дестабилизацию генома рыб.
Результаты микроэлектрофореза ДНК соматических клеток после электромагнитного и лазерного облучения, а также результаты анализа состояния ДНК семени быков в процессе хранения показали,
что этот метод может быть интегрирован в набор приемов регистрации нарушений морфологии ядер для повышения надёжности оценки уровня дестабилизации генома клеток при генотоксических воздействиях на организм животных.
Впервые установлено, что показатель отношения площади ядра к совокупной площади всех ядрышек клетки снижается у коров, положительных в РИД.
1.4. Теоретическая и практическая значимость работы.
Теоретическая значимость полученных результатов заключается в
том, что вскрыта способность клеточных популяций отвечать на
отбор по дестабилизации генома. Достаточно отбора в 4-5-ти
генерациях для направленного снижения или повышения
дестабилизации генома клонов клеток. Обнаруженные связи частот
интерфазных мостов, микроядер и "хвостатых ядер" свидетельствует
о том, что эти элементы нарушений морфологии ядра являются
отражением одного процесса - дестабилизации генома клетки.
Полученные факты о связи носительства коровами вируса лейкоза с
состоянием интерфазных ядрышковых организаторов
свидетельствует о влиянии вируса на рибосомные цистроны.
Практическая значимость работы состоит в том, что разработанный и апробированный способ отбора клеточных популяций перевивных опухолей на стабильность генома (отбор на частоту клеток с интерфазными мостами) можно использовать в биотехнологическом производстве для генотипической стабилизации клеточных линий. Комплексный подход в оценке частоты нарушений морфологии ядер повышает надежность оценки дестабилизации генома при влиянии физических, химических и биологических факторов внешней среды, в том числе и в оценке экологии.
1.5. Апробация результатов диссертации. Материалы
диссертационной работы доложены на 40-й научно-практической
конференции профессорско-преподавательского состава (Астрахань,
1996), 18-м международном хонгрессе генетиков (Пекин, 1998), 17-м
международном конгрессе по исследованию рака (Рио-де-Жанейро,
1998), на научно-практической конференции 'ТЗклад молодых
учёных в решение задач научного обеспечения АПК Северо-Запада
РФ" (Санкт-Петербург-Пушкин, 1999), 11-м международном
конгрессе по гистохимии и иммуноцитохимии (Йорк,
Великобритания, 2000), 23-й конференции по исследованию
полисахаридов (Токио, Япония, 2002), на международной
конференции "Сохранение генетических ресурсов" (Санкт-
Петербург, 2004), 1-й международной научно-практической
конференции (Астрахань, Россия, 2005), на 4-й международной
конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 научные работы, в том числе два патента на изобретения. Работы опубликованы в материалах международных конференций и в журналах: «Генетика», «Доклады Академии Наук», «Доклады РАСХН», «Цитология», «Ветеринария», «J. of Cytogenetics Cell Genetics», «Вопросы онкологии», «J. of Neurochemical Research», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», «J. of Molecular Medicine».
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы из 435 источников, среди которых 330 на иностранном языке. Диссертация изложена на 299 страницах, содержит 43 таблицы, 49 рисунков.
1.8.0сновные положения, выносимые на защиту.
-частота клеток с интерфазными мостами в клонах перевивной рабдомиосаркомы РА-23 является наследственно гетерогенной и подвержена селективному отбору на повышение или снижение дестабилизации генома;
-клоны с высокими и низкими частотами интерфазных мостов отличаются между собой по частоте клеток с кариотипическими изменениями и частоте клеток с нарушениями морфологии ядер;
- комбинированное воздействие переменного низкоэнергетического магнитного поля и лазерного облучения влияет на формирование экспериментальных метастазов и частоту интерфазных ЯОР клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс;
-электромагнитные волны гектагерцового диапазона оказывают влияние на функциональное состояние кроветворной и репродуктивной систем;
-показатели морфологических нарушений ядер клеток периферической крови рыб являются значимыми для целей экотоксикологического мониторинга;
-микроядерный тест и метод "микроэлектрофорез ДНК одиночных
клеток" повышают надёжность оценки нестабильности генома
клеток при исследовании влияния переменного
низкоэнергетического магнитного поля и лазерного облучения;
-метод "микроэлектрофорез ДНК одиночных клеток" позволяет оценивать стабильность ДНК семени быков;
-выявление нарушенной морфологии ядер с использованием цитокинетического. блока позволяет учитывать "скрытую" нестабильность генома у сельскохозяйственных животных;
- кариоморфометрические показатели и функциональная активность лимфоцитов периферической крови у коров, положительных в РИД, отличаются от аналогичных показателей здоровых животных.
