Введение к работе
Актуальность темы. В нашей стране и за рубежом получены десятки телят из ооцитов, выделенных из яичников,убиваемых на мясокомбинатах коров и телок. Широкое применение этого биотехнологического приема в практике в значительной мере определяется возможностью долговременного хранения таких ооцитов. Если эмбрионы крупного рогатого скота замораживаются без существенной потери жизнеспособности, то об ооци-тах этого пока сказать нельзя. Есть сообщения о первых успехах в этой области <, Qracfew& , 19ЬЫ. Выход таких эмбрионов остается крайне низким и требуются дальнейшие исследования с целью разработки более совершенных методических приемов консервации, позволяющих повысить оплодотворяе-мость деконсервированных ооцитов.
Банки ооцитов могли бы стать основой устойчивых и дешевых источников потенциальных эмбрионов, что является, в оп-' ределенной мере, лимитирующим условием программы их трансплантации. Хранение сравнительно больших количеств однотипных женских гамет создает предпосылки для расширения комбинаторики сочетания родительских.пар при подборе, что имеет немаловажное значение в селекционно-генетической работе. Этот прием создает одно из перспективных направлений в сохранении генетических ресурсов редких, эндемичных и особо ценных животных. Банки ооцитов, наконец, должны будут стать одной из основ для работ в области генной и клеточной инженерии, экспериментальной эмбриологии, физиологии и биохимии воспроизводства. Криорезистентность ооцитов невелика и существует целый ряд нерешенных вопросов в проблеме их замораживания. Один'из них'состоит в том, как снизить потери жизнеспособно-' сти ооцитов уже на первом этапе предконсервационной обработки - экспонировании в растворах криопротекторов в консервирующий среде. Нет ясности и в том, какие сочетания криопротекторов. и их концентрации 'могут достаточно заметно снизить уровень криоповреждений при разных скоростях охлаждения у : ооиптов на различных стадиях развития. Не предпринималось ( попыток поиска путей искусственного снижения восприимчивости к токсическим,факторам консервирующей среды и повышения, та-; ким образом, их крисрсзистеитиости. Наиболее перспективным
4 "
представляется индуцирование обратимого торможения окислительно-восстановительных реакций, при котором может, снижаться восприимчивость клеток к экстремальным факторам внешней среды в соответствии с известным биологическим законом.
Целью и задачами настоящей работы явилось изучение условий, способствующих повышению жизнеспособности ооцитов и их способности .к экстракорпоральному оплодотворению. При этом особое внимание придавалось поиску путей снижения их потерь на первом этапе предконсервационной подготовки. В связи с этим были поставлены, следующие задачи:
-
Изучить, как повлияет на жизнеспособность и оплодотворне-мость предконсервационная подготовка ооцитов, а, именно, экспонирование в .различных по содержанию криопротекторов, консервирующих растворах.
-
Выяснить оптимальный состав криопротекторов для программируемого и сверхбыстрого охлаждения ооцитов на разных стадиях развития. * "
-
Изучить эффективность некоторых криофилактичес'ких веществ в качестве компонентов консервирующей среды.
4. Определить адекватность отдельных методов.оценки жизнеспособности деконсервированных ооцитов.
. 5. Изучить возможность повышения криореэистентности- ооцитов . с помощвю предконсервационной обработки их факторами вызывающими обратимое торможение обменных процессов.
Научная новизна: .
Впервые проанализировано влияние экспонирования ооцитов в различных растворах эндо- и экзрцеллюлярных криопротекторов на, их жизнеспособность и оплодотворяёмость. Разработан методический подход к подбору комплекса криопротекторов для их замораживания, способного защитить как генетический аппарат клетки, так и ее мембраны. Разработан способ искусственного индуцирования в клетках повышенной устойчивости к токсическим факторам консервирующих сред и получено положительное решение по заявке на патент "Способ низкотемпературной консервации ооцитов крупного рогатого.скота". Сформулирован лринцып подготовки биологических объектов к замораживанию.
Практическая ценность работы. Разработан способ низкотемпературной консервации ооцитов, 'обеспечивающий технологическую
5
основу Для создания их банков. ,
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на отчетах лаборатории криоконсервации ооци-тов крупного рогатого скота в I990-I99I гг., на аспирантских сессиях I990-1992 гг.
Публикации. По теме исследований опубликовано 3 статьи.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и списка литературы, включающего " 170 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Объем диссертации составляет /// страниц машинописного текста, включает J таблиц и ГО рисунков.