Введение к работе
Актуальность исследования. Под диминуцией хроматина (ДХ) понимается круг генетических процессов,приводящих к неравноценности в количественном и качественном отношении геномов клеток зародышевой плазмы и соматических тканевых клеток.
Феномен ДХ был открыт Бовери в 1887г. (Boveri,1887). Особый интерес представляет ДХ у циклопов (Crustacea.Copepoda),где она заключается в элиминации на ранних стадиях развития большей или меньшей части хромосомного материала из зародышевых соматических клеток. Явление ДХ имеет множество интересных для фундаментально** и прикладной биологии аспектов,начиная от эмбриологии,кончая методологией генной инженерии. Согласно Шапиро (Shapiro,1992), диминуция хроматина относится к тем процессам,которые можно рассматривать в качестве примеров генной инженерии в природе. Наибольшее значение ДХ представляет для понимания организации хромосом высших эукариот. Сам процесс ДХ наглядно показывает, какая часть генома необходима и достаточна для нормального функционирования практически всех тканевых клеток по крайней мере тех организмов, у которых она встречается.
К настоящему времени ДХ известна у немногих видов эукариот (Райков,1992; Beermann,1977; Ammermann,1985; Tobler,1986;Pimpinelli,Goday, 1989; Tobler et al.,1992).поэтому особую актуальность приобретают исс-педования тех объектов,в частности представителей рода Cyclops,у которых ДХ затрагивает значительную,в идеале максимальную долю генома соматических клеток.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение іроцесса ДХ у двух представителей рода Cyclops - Cyclops kolensis Li 11 л подвида Cyclops strenuus strenuus Fischer, отличного по картине ДХ зт вида С.strenuus,который описала Берман (Beermann,1977). Были поставлены следующие задачи:
1.Провести с помощью цитофотометрии фельгеновской реакции срав-іение содержания ДНК в клетках обоих видов циклопов до и после ДХ.
2.Исследовать цитологически с помощью светового и электронного іикроскопа процесс ДХ у С.kolensis,обращая особое внимание на иэмене-же структуры хромосом.
- Л -
3.Изучить с помощью электронной микроскопии структуру гранул элиминируемого хроматина у C.kolensis.
Научная новизна. Впервые обнаружен вид эукариот - C.kolensis, у которого после рекордной потери генетического материала - более 90 в соматических клетках полностью сохраняется число и типичная структура митотических хромосом. Этот факт указывает на то,что у c.kolensis более 90 хромосомной ДНК не связана как с кодирующими,так и с регуляторними функциями, необходимыми для дифференцировки соматических клеток.
Обнаружен подвид C.strenuus strenuus диплоидное количество хромосом у которого,а также картина и график диминуционных процессов отличаются от описанных ранее для вида Cyclops strenuus Берман (Beermann, 1977).
Показано,что репликация ДНК у C.kolensis завершается до диминуции хроматина .
Установлено,что хромосомы C.kolensis в преддиминуиионном митозе без какой-либо предобработки проявляют сегментацию,типичную для С-дис-ков млекопитающих.
впервые описана мембрана,окружающая гранулы элиминируемого хроматина у многоклеточного эукариотического оргаииаиа, которая в отличие от ядерной мембраны эукариотических клеток однослойная и в ней отсутствуют поры.
Впервые у представителей колепод в тканях взрослых циклопов C.kolensis и C.strenuus strenuus,обнаружены высокополиплоидные клетки, возникшие на основе постдиминуционного генома.
Впервые у многоклеточного эукариотического организма изучена структура хромосом и интерфазных ядер зародышевых клеток до и после ДХ при помощи электронной микроскопии.
На основе полученных данных высказано предположение: процесс, подобный ДХ у C.kolensis и C.strenuus strenuus, должен предшествовать смене типов интерсперсим последовательностей различной степени повторяемости в неходирующей части генома,многократно происходившей в ходе эволюции эукариот.
Практическая значимость. 1.Специфика картины ДХ - количественная и качественная - может быть использована в качестве критерия при опре-
делении видов рода Cyclops. Известно,что идентификация видов этого рода по стандартным морфологическим признакам представляет большие трудности даже для зоологов-систематиков.
2.Можно полагать,что в результате ДХ у C.kolensis в генетических локусах хромосом соматических клеток сохраняется минимальное число функционально значимых последовательностей ДНК .В таком случае дальнейшие исследования молекулярной структуры таких минилокусов окажутся полезными для оптимизации методов конструирования фрагментов донорной ДНК, используемых в генной инженерии, и в частности, при генотерапии наследственных болезней человека. Положения выносимые на защиту:
Открытие у C.kolensis рекордной для многоклеточных организмов доли генома,элиминируемой при ДХ из ядер соматических клеток;
Обнаружение подвида C.strenuus с отличными от известных ранее для этого вида цитогенетическики характеристиками, такими как: диплоидное число хромосом,общая картина и график диминуционных процессов;
Описание процесса ДХ у C.kolensis;
Обнаружение спонтанной G-подобной поперечной сегментации хромосом :.kolensis в преддиминуционном митозе;
Обнаружение специфической структуры мембран, окружающих гран'-элиминируемого хроматина;
Сравнение ультраструктури митотических хромосом и интерфаэных ідер клеток зародыша c.kolensis до и после дх.
Публикации. Основные результаты исследований, представленные в шссертациоиной работе,изложены в семи журнальных статьях,три из кото->ых находятся в печати.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были [оложены на научных семинарах и на заседании Ученого совета Института іиологии внутренних вод им.И.Д.Папанина РАН (1991-1995) , на научных :еминарах Института химической физики им.Н.Н.Семенова РАН (1991-1993), нститута. общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН (1994), Института молеку-ярной генетики РАН (1995), Института цитологии РАН (1994), на заседа-ии Санкт-Петербургского отделения ВОГиС,посвященном 90-летию со дня ождения А.А.Прокофьевой-Бельговской (30 марта 1993 г.),на кеждународ-ой конференции по "Эволюционной генетике и адаптации", посвященной
- б -
памяти Жака Моно (Оссуа, Франция, 25-29 сент. 1995).
Структура и объем диссертации. Материал диссертации, состоящий из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов, обсуждения и выводов, представлен на 101 машинописной странице, включая 4 таблицы и 21 рисунок. Список литературы включает 171 работу, из них 140 работ на иностранных языках. Общий объем диссертации составляет 119 страниц машинописного текста.