Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Особенности спонтанного и индуцированного мутагенеза в соматических клетках человека с различным эпигенетическим фоном Васильев Станислав Анатольевич

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Васильев Станислав Анатольевич. Особенности спонтанного и индуцированного мутагенеза в соматических клетках человека с различным эпигенетическим фоном: диссертация ... доктора Биологических наук: 03.02.07 / Васильев Станислав Анатольевич;[Место защиты: ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук»], 2018

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Стабильность генома является неотъемлемым свойством всех живых организмов (Jeggo P.A. et al., 2016). Ее качественной составляющей является последовательность генов, за сохранение которой отвечает система репарации ДНК (Лаврик О.И. и др., 2016). Однако не меньшую роль играют количественный и структурный аспект, отражающие копийность генов и их расположение на хромосомах, вследствие чего определяющую роль в выживании организма играет постоянство кариотипа (Liang G., Chen H., 2015). Геномная стабильность на уровне кариотипа в значительной степени также поддерживается за счет систем репарации ДНК (Лаврик О.И. и др., 2016). Необходимость сохранения кариотипа наиболее хорошо иллюстрируется фатальными последствиями хромосомных нарушений на уровне целого организма. Так, у человека анеуплоидия по подавляющему большинству хромосом приводит к гибели эмбрионов на ранних стадиях развития, а числовые нарушения по оставшимся хромосомам связаны со значительным снижением жизнеспособности (Никитина Т.В., Лебедев И.Н., 2014). То же касается и крупных структурных хромосомных нарушений (Voet T. et al., 2011).

Нормальный хромосомный состав наиболее критичен именно для эмбрионального этапа развития в силу важности и сложности протекающих процессов дифференцировки, роста и развития организма (Кузнецова Т.В., Баранов В.С., 2007). Тем не менее, развитие многоклеточности привело к снижению давления отбора по стабильности генома отдельных соматических клеток за счет исключения передачи их генов следующему поколению, специализации их функций и компенсации негативных эффектов хромосомных нарушений за счет соседних клеток с нормальным генотипом. В результате во взрослом организме происходит постоянное накопление хромосомных нарушений разного размера. Наиболее крупной и распространенной аномалией кариотипа в соматических клетках человека является анеуплоидия, которая в условиях in vitro возникает в 1% диплоидных клеток в каждом митотическом делении (Thompson S.L., Compton D.A., 2008). Частота анеуплоидных клеток in vivo варьирует в различных тканях, являясь максимальной в мозге и печени (Yurov Y.B. et al., 2007; Duncan A.W. et al., 2012). Кроме того, в клетках возникают структурные повреждения ДНК, при неправильной репарации или ее отсутствии приводящие к образованию хромосомных аберраций. Известно, что частота клеток, несущих многие из этих хромосомных повреждений, повышается с возрастом (Fenech M., Bonassi S., 2011; Rube C.E. et al., 2011) или вследствие различных мутагенных воздействий (Druzhinin V.G. et al., 2015; 2016). В результате в определенный момент онтогенеза организм представляет собой «лоскутное одеяло» из множества клеток, несущих различные отклонения от нормального кариотипа, характерного для зародышевой линии.

Накопление подобных нарушений неизбежно и связано с развитием различных возраст-зависимых патологий, таких как сердечно-сосудистые и неврологические заболевания (Andreassi M.G., 2008; Coppede F., Migliore L., 2010; Krestinina L.Y. et al., 2013). Кроме того, главным следствием постоянно накапливающихся хромосомных повреждений в клетках является канцерогенез (Имянитов Е.Н., 2010; Jeggo P. et al., 2016). Возникновение хромосомных нарушений и сохранение несущих их клеток в ходе онтогенеза во многом лежит в основе старения. Однако темп этих процессов может значительно различаться между индивидами, приводя к формулировке понятия «биологический возраст», который может отличаться от календарного как в одну, так и в другую сторону (Москалев А.А. и др., 2016). Неблагоприятные факторы внешней среды, включая воздействие ионизирующего излучения, играют важную роль в повышении частоты хромосомных нарушений (Vozilova A.V. et al., 2013). Однако эндогенные факторы, влияющие на скорость возникновения и накопления хромосомных нарушений в клетках организма, остаются во многом неясными.

Достаточно давно стало понятным, что в нарушении стабильности генома могут играть важную роль генетические факторы. Это подтверждается существованием ряда синдромов, обусловленных мутациями в генах репарации ДНК и характеризующимися повышенной хромосомной нестабильностью. Кроме того, по-видимому, на частоту хромосомных нарушений в соматических клетках человека могут влиять и полиморфные варианты в генах антиоксидантной защиты, репарации ДНК, апоптоза и метаболизма ксенобиотиков. Однако различная чувствительность к мутагенному воздействию клеток в организме на различных стадиях онтогенеза на фоне одинакового генотипа по определенному набору полиморфных вариантов поднимает вопрос о наличии эпигенетических факторов, влияющих на стабильность генома.

Одним из таких факторов может являться глобальный уровень метилирования генома, снижение которого в онтогенезе часто сопровождается повышением частоты хромосомных нарушений. Наиболее распространенным в геноме человека (около 17 % генома) является семейство ретротранспозонов LINE-1 (long interspersed nuclear element 1) (Ostertag E.M., Kazazian H.H., 2001). Известно, что снижение глобального уровня метилирования ДНК, как это происходит, например, при синдроме ICF, приводит к синтезу большого количества транскриптов ретротранспозонов, ретротранспозиции и встраиванию их в новые сайты в геноме. Возможной причиной влияния снижения глобального уровня метилирования генома на частоту анеуплоидии может быть гипометилирование цитозина в центромерных и прицентромерных повторяющихся последовательностях хромосом (Schueler M.G., Sullivan B.A., 2006; Pironon N. et al., 2010; Fenech M. et al., 2011), приводящее к нарушению целостности кинетохора и возникновению ошибок прикрепления микротрубочек к хромосомам и неправильной работе контрольной точки сборки веретена деления (Gieni R.S. et al., 2008; Heit R. et al., 2009). Кроме того,

активация ретротранспозонов в результате гипометилирования их промоторов может индуцировать накопление двунитевых разрывов ДНК и повышенный уровень инсерционного мутагенеза. Влияние резкого снижения глобального уровня метилирования прослеживается и при воздействии 5-азацитидином (ингибитором ДНК-метилтрансферазы), которое приводит к хромосомной нестабильности (Guttenbach M., Schmid M., 1994; Gieni R.S. et al., 2008).

Помимо уровня метилирования генома, наиболее изученным эпигенетическим феноменом, связанным с поддержанием стабильности генома, является фосфорилирование гистона H2AX (H2AX), приводящее к формированию фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК. Эти структуры представляют собой собранные комплексы, состоящие из собственно белков репарации двунитевых разрывов ДНК и сигнальных медиаторов, участвующих в активации компонентов контрольных точек клеточного цикла. Поэтому, клетки, содержащие фокусы H2AX, имеют измененный эпигенетический фон, потенциально влияющий на функционирование белков репарации ДНК и экспрессию кодирующих их генов. Вследствие этого клетки могут эффективнее реагировать на воздействие мутагенов за счет уже активированной системы ответа на повреждение ДНК. В свою очередь, повышенная активность систем репарации ДНК и контрольных точек клеточного цикла может приводить к снижению спонтанной и индуцированной мутагенами частоты хромосомных нарушений. Однако возможность такого ответа и его механизмы остаются неясными. Это обусловливает необходимость анализа особенностей спонтанного и индуцированного мутагенеза в соматических клетках человека с различным спонтанным уровнем фокусов H2AX, а также выявления дифференциально-экспрессирующихся генов, определяющих влияние спонтанного уровня фокусов H2AX на эффективность репарации ДНК.

Степень разработанности темы исследования. Многочисленные исследования отечественных и зарубежных авторов указывают на то, что обеспечение стабильности генома в клетках зависит от генетических причин, таких как вариации на уровне последовательности ДНК или экспрессии генов репарации ДНК, метаболизма ксенобиотиков, антиоксидантной защиты (Aka P. et al., 2004; Angelini S. et al., 2005; Kirsch-Volders M. et al., 2006; Фрейдин М.Б. и др., 2007; Iarmarcovai G. et al., 2008; Cho Y.H. et al., 2009; Сальникова Л.Е. и др., 2009; Andreassen C.N., 2010; Иванова Т.И. и др., 2010; Васильева З. и др., 2012; Larionov A.V. et al., 2016; Minina V.I. et al., 2017). Однако известные полиморфные варианты могут объяснить лишь небольшую часть наследуемости количественных признаков, что приводит к возникновению феномена «потерянной наследуемости» (Manolio T.A. et al., 2009). Причинами такой «недостающей наследуемости» могут быть как вариации в до сих пор недостаточно исследованных регуляторных областях генома, так и эпигенетические механизмы реализации генетической информации в фенотипе (Trerotola M. et al., 2015). В связи с этим, все больше исследований направлено на выявление механизмов регуляции экспрессии

генов и характеристику эпигенетических механизмов патогенеза многих заболеваний с наследственной компонентой. Появляется все больше данных о роли эпигенетики в развитии различных патологий у человека, включая проблемы репродукции (Baranov V.S. et al., 2015; Саженова Е.А. и др., 2017), онкологические (Залетаев Д.В. и др., 2004; Narayanan S.P. et al., 2017), сердечно-сосудистые (Nazarenko M.S. et al., 2015; Khyzha N. et al., 2017) и неврологические заболевания (Younus I., Reddy D.S., 2017). Тем не менее, недостаточно изученной остается область влияния эпигенетического фона на поддержание базовых механизмов обеспечения стабильности генома, играющих важную роль в патогенезе многих заболеваний.

Цель исследования

Выявить связь эпигенетической организации генома со спонтанным и индуцированным уровнем хромосомных нарушений в соматических клетках человека.

Задачи исследования

  1. Оценить связь уровня метилирования ретротранспозона LINE-1 с частотой хромосомных нарушений в экстраэмбриональных клетках эмбрионов человека и лимфоцитах на постнатальном этапе онтогенеза.

  2. Охарактеризовать связь между спонтанным уровнем фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК и частотой хромосомных нарушений в клетках человека на различных стадиях онтогенеза при воздействии ионизирующего излучения в условиях in vitro.

  3. Определить динамику уровня фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК и хромосомных нарушений в лимфоцитах человека после воздействия ионизирующего излучения в условиях in vivo в ходе лучевой терапии злокачественных новообразований.

  4. Выявить дифференциально-экспрессирующиеся гены в лимфоцитах индивидов, различающихся по эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК, и оценить их связь с репарацией ДНК в других типах клеток.

  5. Экспериментально проверить участие выявленных дифференциально-экспрессирующихся генов в обеспечении выживаемости клеток, репарации ДНК и эпигенетической регуляции экспрессии генов в нокаутных опухолевых клеточных линиях, полученных с использованием системы редактирования генома CRISPR/Cas9. Новизна исследования, уровень новизны. В исследовании впервые

обнаружены эффекты ряда эпигенетических модификаций хроматина (индекса метилирования ретротранспозона LINE-1 и уровня фокусов фосфорилированного гистона H2AX) на возникновение спонтанных и индуцированных хромосомных нарушений в клетках человека на различных этапах онтогенеза. Впервые обнаружено гипометилирование ретротранспозона LINE-1 в хорионе и экстраэмбриональной мезодерме 79 % и 60 % спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, соответственно, что может являться отражением патологических процессов, приводящих к

эмбриональной гибели. Кроме того, в ворсинах хориона спонтанных абортусов с нормальным кариотипом выявлена повышенная спонтанная частота анеуплоидии по хромосомам 8 и X, которая при этом отрицательно коррелирует с индексом метилирования ретротранспозона LINE-1. В лимфоцитах взрослых индивидов выявлена отрицательная корреляция индекса метилирования LINE-1 со спонтанной частотой микроядер. При хроническом воздействии ионизирующего излучения регистрируется отрицательная корреляция индекса метилирования LINE-1 с частотой индуцированных аберраций хроматидного типа и сестринских хроматидных обменов.

Впервые выявлено влияние спонтанного уровня фокусов H2AX на частоту хромосомных нарушений в соматических клетках человека. Была выявлена отрицательная корреляция спонтанного уровня фокусов H2AX в лимфоцитах больных злокачественными новообразованиями до нейтронной терапии с частотой аберраций хромосомного типа после окончания терапии. Данный эффект подтверждался в лимфоцитах здоровых индивидов в условиях in vitro: наблюдалась статистически значимая отрицательная корреляция спонтанного уровня фокусов H2AX с частотой центромеро-негативных микроядер после воздействия радиации в дозе 2 Гр in vitro в лимфоцитах здоровых индивидов.

Впервые были выявлены дифференциально-экспрессирующиеся гены, связанные со спонтанным уровнем фокусов H2AX в соматических клетках человека. Эксперимент по оценке экспрессии некоторых из выявленных дифференциально-экспрессирующихся генов в фибробластах экстраэмбриональной мезодермы медицинских абортусов позволил обнаружить статистически значимую отрицательную корреляцию экспрессии генов ADAMTS1, WHSC1 и RBFOX2 со спонтанным уровнем фокусов H2AX, и экспрессии генов ADAMTS1 и WHSC1 с частотой радиационно-индуцированных микроядер после воздействия гамма-излучением.

Впервые созданы клеточные линии HeLa с нокаутом генов ADAMTS1, THBS1, RBFOX2 и WHSC1. Обнаружено, что исследуемые гены связаны сетью взаимной транскрипционной регуляции. Были впервые обнаружены эффекты нокаута генов ADAMTS1, THBS1, RBFOX2 и WHSC1 на выживаемость необлученных и облученных клеток. Выявлено, что нокаут генов WHSC1 и THBS1 приводит к снижению, а нокаут гена RBFOX2 – к повышению эффективности посева необлученных клеток линии HeLa. После воздействия ионизирующего излучения нокаут генов WHSC1, ADAMTS1 и RBFOX2 приводит к снижению клональной выживаемости опухолевой клеточной линии HeLa. Обнаружено влияние нокаута гена WHSC1 на повышение спонтанного уровня фокусов H2AX и 53BP1.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют имеющиеся теоретические представления о механизмах поддержания целостности и стабильности хромосомного аппарата соматических клеток человека. Получены новые данные о влиянии эпигенетических модификаций хроматина в соматических клетках человека на спонтанную и радиационно-индуцированную частоту хромосомных

нарушений. Это указывает на необходимость учета межиндивидуальной вариабельности по эпигенетическим маркерам при проведении различных процедур, связанных с воздействием мутагенных факторов на человека.

Выявление генов, ответственных за формирование индивидуального ответа соматических клеток человека на воздействие радиации, открывает широкие возможности для характеристики механизмов их регуляции и влияния на экспрессию множества других генов. Созданные нокаутные клеточные линии по отдельным генам с помощью технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 позволяют перейти к выявлению причинно-следственных связей между нарушением экспрессии отдельных генов и изменением выживаемости клеток и эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК. Проведенный анализ экспрессии регуляции транскрипции в различных соматических клетках человека и созданных нокаутных линиях дает возможность построить сети регуляции экспрессии генов, продукты которых участвуют в процессах контроля стабильности генома. В целом, полученные результаты расширяют понимание механизмов, задействованных в формировании хромосомных нарушений в клетках человека.

Методология и методы исследования. Методологической и теоретической основой исследования послужили труды отечественных и зарубежных ученых в области влияния эпигенетических факторов на стабильность генома. В работе выдвинуты две основные гипотезы, предполагающие связь эпигенетических модификаций хроматина с частотой спонтанных и индуцированных мутагенами хромосомных нарушений: 1) гипометилирование LINE-1 связано с повышением частоты хромосомных аберраций; 2) повышенный спонтанный уровень фокусов H2AX в клетках активирует систему ответа на повреждения ДНК.

В работе использован комплекс современных цитогенетических, молекулярно-генетических, иммуногистохимических, биоинформационных и статистических методов. В частности, применены различные методы анализа стабильности генома, включая оценку частоты хромосомных аберраций, микроядер, сестринских хроматидных обменов, уровня и динамики фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК. Использовались современные методы полнотранскриптомного анализа экспрессии генов с помощью экспрессионных микрочипов, результаты которого подтверждались с помощью ПЦР в реальном времени как в тех же образцах, так и в клетках других типов. Проведен блок работ в модельных системах в условиях in vitro. Для этого с помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9 созданы нокаутные опухолевые клеточные линии, в которых проведена валидация участия выявленных дифференциально-экспрессирующихся генов в обеспечении стабильности генома. В работе использованы различные методы секвенирования генома, включая пиросеквенирование для оценки индекса метилирования ретротранспозона LINE-1 и массовое параллельное секвенирование для анализа последовательности мутаций, полученных с помощью технологии CRISPR/Cas9.

Положения, выносимые на защиту

  1. Гипометилирование генома связано с повышенной спонтанной частотой анеуплоидных клеток в экстраэмбриональных тканях внутриутробно погибших эмбрионов человека с нормальным хромосомным набором и с частотой микроядер в лимфоцитах на постнатальных этапах онтогенеза.

  2. Снижение уровня глобального метилирования генома в лимфоцитах ассоциировано с повышением числа двунитевых разрывов ДНК в S- и G2-фазах клеточного цикла, репарируемых гомологичной рекомбинацией.

  3. Уровень и динамика фокусов белка 53BP1 в ходе репарации двунитевых разрывов ДНК связаны с выживаемостью опухолевых клеточных линий, а спонтанный уровень фокусов гистона H2AX обратно пропорционален частоте хромосомных нарушений после воздействия радиации в лимфоцитах периферической крови, но не в фибробластах экстраэмбриональной мезодермы.

  4. Гены ADAMTS1, RBFOX2, WHSC1 и THBS1, экспрессия которых зависит от спонтанного уровня фокусов H2AX в различных типах соматических клеток человека, связаны взаимной транскрипционной регуляцией и влияют на выживаемость клеток. Степень достоверности результатов. Достоверность полученных данных

обеспечивается репрезентативным объемом выборок, использованием высокоразрешающих молекулярно-генетических методов исследования, нокаутных модельных систем in vitro, а также биоинформационных алгоритмов анализа данных и современных пакетов статистических программ. Апробация материалов диссертации. Результаты исследования были представлены в форме устных и стендовых докладов на IV-VI Международных конференциях по радиации и ее применению в различных областях исследований (Ниш, Сербия, 2016; Будва, Черногория, 2017; Охрид, Македония, 2018), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Конференциях европейского общества генетики человека (Гетеборг, Швеция, 2010; Нюрнберг, Германия, 2012; Глазго, Шотландия, 2015; Барселона, Испания, 2016), VI, VII и XII Региональных конференциях молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011, 2012, 2017), Невском радиологическом форуме (Санкт-Петербург, 2011), III Республиканской научно-практической конференции «Радиационная безопасность Республики Саха (Якутия)» (Якутск, 2011), X международном симпозиуме по хромосомным аберрациям (ISCA10, Амальфи, Италия, 2012), Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2012), Конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2012), VI международной научно-практической конференции «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения (Северск-Томск, 2013), VI Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Ростов-на-Дону, 2014), Международной молодежной научной конференции «Современные проблемы генетики,

клеточной биологии и биотехнологии» (Томск, 2014), Международной конференции «Хромосома» (Новосибирск, 2015), Международных конференциях «Перспективы развития фундаментальных наук» (Томск, 2016, 2017, 2018), Международной конференции «Физика рака» (Томск, 2017); VII Международной школе «Геномика и биология живых систем» (Звенигород, 2016), Всероссийской конференции «50 лет ВОГиС: успехи и перспективы» (Москва, 2016), Конференции «Актуальные проблемы радиобиологии и астробиологии» (Дубна, 2016), II Всероссийской конференции «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск, 2017), Конференции «Биотехнологии – медицине будущего» (Новосибирск, 2017), Международной конференции «Хромосомы и митоз» (Новосибирск, 2017), Научных конференциях «Генетика человека и патология» (Томск, 2011, 2017). Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании Президиума Томского научного центра СО РАМН (Томск, 2016), а также на межлабораторном семинаре в НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ (Томск, 2018).

Личный вклад автора. Диссертационная работа является самостоятельным научным трудом, выполненным на базе лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ. В работе использован материал, полученный автором совместно с сотрудниками лаборатории. Автор лично осуществлял планирование и участвовал в проведении всех экспериментов. Анализ фактического материала, статистическая обработка, обобщение данных и оформление результатов исследований в виде статей в значительной степени проведены лично автором.

Публикации. По теме исследования опубликовано 59 работ, в том числе 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук, 2 монографии, 1 патент.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 330 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования с обсуждением, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Библиографический указатель включает 609 источников, из них – 31 публикация в отечественной литературе, 578 – в зарубежной печати. Диссертация иллюстрирована 54 рисунками и содержит 26 таблиц.