Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Структура популяции вида Лрй mellifera L - 8
1.1. Изучение подвидов A.m.mellifera - 8
1.2. Внутривидовая систематика и филогеография медоносной пчелы... - 39
1.3. Проблема сохранения подвидов A.mellifera - 57
Глава II. Материалы и методы - 76
П.1. Характеристика объекта - 76
П.2. Характеристика выборки объекта исследования - 77
П.З. Методики проведения исследований - 83
П.4. Межгенный локус COI-COII (мтДНК) - 83
П.5. Фрагмент гена второй субъединицы NADH дегидрогеназы (Nd2) мтДНК - 86
П.6. Фрагмент гена антибактериального пептида дефензина (ядерная ДНК) - 89
П.7. Микросателлитный локус ар049 (ядерная ДНК) - 90
П.8. Микросателлитный локус ар243 (ядерная ДНК) - 92
П.9. Микросателлитный локус 4А110 (ядерная ДНК) - 94
П.10. Статистическая обработка результатов - 96
Глава III. Поиск и генетическая характеристика популяций медоносной пчелы на Урале - 97
III. 1. Поиск сохранившихся популяций A.m.mellifera на основе полиморфизма межгенного локуса COI-COII мтДНК 98
Ш.2. Вариабельность фрагмента гена дефензина ядерной ДНК в популяциях A.m.mellifera на Урале - 103
III.3. Вариабельность микросателлитных локусов ар243 и 4аП0 в популяциях A.m.mellifera на Урале - 104
Ш.4. Генетические характеристики популяций A.m.mellifera на Урале - 106
III.5. Вариабельность нуклеотидной последовательности фрагмента -
remND2 мтДНК и филогенетический анализ 117
Заключение - 144
Выводы - 146
Список литературы - 147
Приложение - 178
- Изучение подвидов A.m.mellifera
- Характеристика объекта
- Поиск сохранившихся популяций A.m.mellifera на основе полиморфизма межгенного локуса COI-COII мтДНК
Введение к работе
Медоносная пчела Apis mellifera L. по современной классификации подразделяется на 25 подвидов (Engel. 1999), населяющих территорию всей Африки, Европы, Ближнего и Среднего Востока. Подвид Apis mellifera mellifera L. (темная европейская или среднерусская пчела) занимал протяжённую территорию от Британских островов до Урала вдоль северной границы естественного видового ареала. Эволюция этого подвида проходила в суровых природно-климатических условиях, в результате чего он приобрел свойства, обеспечивающие его преимущество перед другими подвидами пчел в Северной Европе (Шафиков с соавт., 2002).
В последнее время в результате хозяйственной деятельности человека, произошла интенсивная гибридизация подвидов пчел, вследствие чего были утрачены их некоторые ценные качества. Считалось, что уже в 80-х годах в Западной Европе невозможно было найти негибридизованные " семьи A.m.meUifera. В СССР A.m.meUifera также была подвержена интенсивной гибридизации в результате завоза пчел из южных регионов страны. Однако предполагалось, что в отдельных местах еще могли сохраниться популяции A.m.meUifera. А.В.Петухов с соавт. (1996) на основе морфометрических исследований пчел сообщали о сохранении популяций A.m.meUifera на территории Пермского края. По мнению В.С.Филатова (2004), популяция A.m.meUifera могла сохраниться в лесах Красноуфимского района Свердловской области. На Урале широко известно об обитании бортевых пчел A.m.meUifera в Бурзянском районе Республики Башкортостан.
Ранее было показано, что морфом етрические методы не всегда позволяют достоверно идентифицировать подвидовую принадлежность пчел (Саттаров, Николенко, 2000), поэтому наши исследования проводились с использованием ДНК-маркеров, которые в большинстве случаев позволяют более точно определять таксономическую принадлежность. А.Г.Николенко и А.В.Поскряков (2002) на основе изучения полиморфизма межгенного локуса С 01-С ОН мтДНК подтвердили, что популяция A.m.mellifera действительно сохранилась на территории Бурзянского района Республики Башкортостан. Последующие исследования не позволили расширить перечень иоиулщяи A.m.mellifera на Урале.
Филогенетика пчел вида A.mellifera на современном этапе развития также является очень спорным вопросом - нет полного согласования морфометрических и молекулярно-генетических данных. Филогенетика, как фундаментальная область знаний, вісгіючает в область своих исследований как кладистику, так и собственно сам филогенез и таксономию. На этом основании филогенетику можно определить как раздел эволюционной биологии, исследующий процесс филогенеза и порожденный этим процессом филогенетический паттерн. Соответственно, можно определить две основные задачи этой дисциплины - изучение процесса филогенеза и структуры филогенетического паттерна (Павлинов, 2005). Для успешного сохранения подвидов пчел A.mellifera надо четко знать его филогенетический паттерн.
Очевидно, что для сохранения генофонда A.m.mellifera на Урале желательно иметь несколько генетических резерватов, а таюке располагать информацией о популяционно-генетической структуре подвида A.m.mellifera и границах ареалов составляющих его локальных популяций. Применение комплекса молекулярно-генетических маркеров для выделения сохранившихся генетических резерватов A.m.mellifera, а таюке углублённая статистическая обработка полученных данных позволят усовершенствовать разработанную ранее стратегию сохранения генофонда этого ценного подвида. Таким образом, для решения вышеизложенных проблем подвида A.m.meUifera была поставлена следующая цель работы:
изучение полиморфизма, генетической структуры и филогенетики подвида Apis mellifera mellifera L. на Урале.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Найти сохранившиеся популяции A.m.meUifera на Урале па основе полиморфизма межгенного локуса СОІ-СОП митохоидриальной ДНК.
2. Определить генетическую структуру обнаруженных популяций A.m.mellifera на основе полиморфизма ядерной и митохоидриальной ДНК.
3. Провести филогенетический анализ подвидов Apis mellifera L. на основе нуклеотидного полиморфизма фрагмента гена 2-ой субъединицы NADH дегидрогеназы (ND2) митохоидриальной ДНК.
Изучение подвидов A.m.mellifera
В конце XIX — начале XX в. выяснилась всеобщность индивидуальной изменчивости признаков и свойств живых организмов, и последующее развитие значительной части биологии было связано с осмыслением этого факта. В биологии второй половины XX в. выяснилась всеобщность популяционной подразделенности видов, и все большее число исследований в разных областях биологии оказывалось связанным с изучением этой подразделенности. На этой основе и возникла популяционная генетика.
Предметом популяционной генетики является популяция, ее структура и функции, ее становление и преобразование в ходе эволюции. Популяция — это минимальная самовоспроизводящаяся группа особей одного вида, на протяжении эволюционно длительного времени населяющая определенное пространство, образующая самостоятельную генетическую систему и формирующая собственное экологическое гиперпространство. Как особого рода биологическая система, популяция характеризуется целостностью и независимостью, структурированностью и динамичностью всех параметров, авторегуляторностыо. полиморфностыо и уникальностью. Популяция — естественно-историческая структура, элементарная единица эволюционного процесса и, что важно практически, основная единица любой формы управления живыми природными ресурсами: эксплуатации, регулирования численности и охраны.
Важность изучения природных популяций часто недооценивается в современных популяционных исследованиях. Если нормальный ход популяционного исследования должен состоять из четырех последовательных этапов (наблюдение — описание, лабораторные или полевые эксперименты, анализ; моделирование, синтез; предсказание), то в современной популяционной биологии исследователи нередко, не проходя первых двух этапов, приступают к третьему. Это делает такие предсказания малонадежными, недолговечными и попросту неинтересными (Яблоков, 1987).
Изучение популяций пчел, естественно, также является основой для понимания ее структуры, систематики вида и разработки методов идентификации подвидов, что очень важно для сохранения подвидов пчел, которые могут потерять свои индивидуальные качества в связи с интенсивной повсеместной гибридизацией в результате увеличения антропогенного влияния на окружающий мир.
Характеристика объекта
Медоносная пчела A.mellifera - социальное насекомое отряда Перепончатокрылых рода настоящих пчел Apis. Пчелиная семья состоит из одной матки, нескольких сотен трутней и до ста тысяч рабочих пчел. Жизнь пчелиной семьи определяется теснейшей взаимосвязью всех составляющих ее особей, что делает их зависимыми друг от друга, но максимально приспособленными к условиям окружающей среды.
Матка - единственная в пчелиной семье женская особь, участвующая в размножении, которая формируется из оплодотворенных яиц. тело которой продолговатое длиной 20-25 мм. и массой 180-250 мг. с хорошо развитыми крыльями, ножками, жалоносным аппаратом и укороченным хоботком, что связано с утратой функции добывания нектара.
Трутни - особи мужского пола пчелиной семьи, которые развиваются из неоплодотворенных яиц и участвуют только в размножении, тело которых широкое, с толстым брюшком и крупной головой длиной 15-17 мм. и массой до 200 мг, с хорошо развитыми крыльями, без жалоносного аппарата, восковых зеркалец, корзиночек на ножках и с недоразвитым хоботком.
Рабочие пчелы - недоразвитые женские особи пчелиной семьи, не участвующие в размножении и выполняющие все работы по поддержанию всех функций и процессов в семье, которые развиваются из оплодотворенных яиц, тело которых длиной 12-14 мм. и массой в среднем 100 мг. Рабочие пчелы составляют основную массу пчелиной семьи, от количества которых зависит сила и медопродуктивность пчелиной семьи (Кривцов с соавт., 1999).
Поиск сохранившихся популяций A.m.mellifera на основе полиморфизма межгенного локуса COI-COII мтДНК
Первой задачей был поиск сохранившихся популяций A.m.mellifera на Урале. На основе предыдущих исследований морфометрическими методами предполагалось, что на Урале сохранилось несколько негибридизованных популяций A.m.mellifera: в Республике Башкортостан на территории Бурзянского, Иглинского и Янаульского районов (Петров, 1964, 1983; Шакиров, 1988, 1990; Ишемгулов с соавт., 1997) и в Пермском крае на территории Уииского и Вишерского районов (Петухов с соавт., 1996; Симанков, 1999). Анализ межгенного локуса СОІ-СОІІ мтДНК (Саттаров с соавт., 2000; Николенко, Поскряков, 2002) позволил обнаружить в Республике Башкортостан только один сохранившийся резерват медоносной пчелы A.m.mellifera на территории Бурзянского района, называемый бурзянской популяцией A.m.mellifera.
Нами был продолжен поиск сохранившихся популяций A.m.mellifera на Урале. Образцы пчел, собранные в разных районах Среднего и Южного Урала, были проанализированы методом ПЦР-анализа межгениого локуса СОІ-СОІІ мтДНК. Частота встречаемости комбинации PQQ межгенного локуса СОІ-СОІІ мтДНК варьировала от 0,57 до 1,00 (табл. ПІЛ). Пчелы, собранные с территории Уинского района Пермского края и Иглинского района Республики Башкортостан (уииская и иглинская популяции) характеризовались довольно низким уровнем частоты встречаемости комбинации PQQ межгенного локуса СОІ-СОЇЇ мтДНК - 0,71 и 0,57, соответственно. Эти результаты позволили нам сделать выводы о соотношении геномов гибридизованных пчелиных семей и семей A.m.mettifera, Таким образом, Уинская популяция, в отличие от ранних предположений А.ВЛетухова с соавт (1996), оказалась гибридной. Возможны несколько вариантов объяснения такого положения. Первое объяснение заключалось в том, что морфометрические методы в случае гибридизации не способны точно отличать гибридных пчел от пчел из чистых линий. Другое объяснение состоит в том, что пчелиные семьи уинской популяции могли подвергнуться гибридизации уже после проведения исследований нашими пермскими коллегами. Иглинская популяция, в целом, оказалась гибридной, хотя, например, большинство семей пасек Кугейко и Орловская характеризовалось частотой встречаемости комбинации PQQ межгенного локуса COI-COII мтДНК 0,90 и 0,93, соответственно. Тем не менее, эти пасеки пока не могут быть выделены в отдельную популяцию A.m.rnellifera, так как расположены в массовом окружении пасек с гибридными семьями, между которыми возможен интенсивный поток генов, так как нет- каких-либо барьеров, препятствующих миграции.
