Содержание к диссертации
Введение
2. Основная часть .9
2.1 Обзор литературы 9
2.1.1 Методология исследований полиморфизма генов и нуклеотидных последовательностей 9
2.1.2 Полиморфные варианты гена миостатина у сельскохозяйственных животных и птиц .20
2.1.3 Полиморфные варианты гена пролактина у сельскохозяйственных животных и птиц .28
2.1.4 Полиморфные варианты гена рецептора D2 дофамина у сельскохозяйственных животных и птиц 32
2.2 Материалы и методы .38
2.2.1 Объект исследований 38
2.2.2 Обоснование подбора полиморфных генов 41
2.2.3 Выделение ДНК из проб крови 44
2.2.4 Оптимизация и проведение ПЦР для выявления генетического полиморфизма в генах миостатина, пролактина и рецептра D2 дофамина .46
2.2.5 Анализ фрагментов ДНК в агарозном геле 49
2.2.6 Статистическая обработка данных 50
2.3 Результаты собственных исследований 53
2.3.1 Частота генотипов у кур разных пород. 53
2.3.2 Уровень гетерозиготности в разных породных группах кур 67
2.3.3 Связь вариантов генотипов кур с показателями живой массы .70
2.3.3.1 SNP MST2109 в гене миостатина MSTN .71
3.3.3.1 SNP MST2244 в гене миостатина MSTN 76
3.3.3.2 Indel-полиморфизм в гене пролактина PRL .81
3.3.3.3 Indel-полиморфизм в гене рецептора D2 дофамина DRD2...86
3.3.3.4 Эффект замещения генотипов .91
2.4 Обсуждение 94
3. Заключение 100
3.1 Выводы 100
3.2 Практические предложения .103
3.3 Перспективы дальнейшей разработки темы 104
Список сокращений .105
Список использованной литературы .106
- Полиморфные варианты гена миостатина у сельскохозяйственных животных и птиц
- Оптимизация и проведение ПЦР для выявления генетического полиморфизма в генах миостатина, пролактина и рецептра D2 дофамина
- Частота генотипов у кур разных пород.
- SNP MST2244 в гене миостатина MSTN
Введение к работе
1.1 Актуальность темы. В современном животноводстве наиболее
актуальными становятся исследования, направленные на поиск и выявление
молекулярно-генетических маркеров, связанных с продуктивностью
сельскохозяйственных животных (Зиновьева и др., 2016). Метод
генотипирования животных, в частности, птицы, по генам, отвечающим за
продуктивные качества, является мощным инструментом в селекционной
работе (Коршунова и др., 2013). Поиск взаимосвязи полиморфных вариантов
генетической изменчивости с мясной продуктивностью кур и использование их
в качестве генетических маркеров позволит повысить эффективность селекции
кур мясного и мясо-яичного направления (Новгородова и др., 2015b). Особенно
актуальными являются исследования по выявлению генетического
полиморфизма в генах напрямую связанных с формированием мышечной
массы кур (Зиновьева и др., 2008). К ним относятся ген рецептора D2
дофамина, ген пролактина и, главным образом, ген миостатина. Изучению этих
генов посвящена настоящая работа.
-
Степень разработанности темы. Во всем мире степень изученности генетики сельскохозяйственной птицы находится на высоком уровне. Геном птицы секвенирован, выявлено большое количество вариантов генетического полиморфизма, в том числе порядка миллиарда SNP (Godoy et al., 2015). Покольку продуктивные качества определяются генетическими факторами (King’Ori, 2011), были найдены полиморфные аллельные варианты в генах, детерминирующих формирование и развитие продуктивных качеств, связанные с повышенной продуктивностью у птиц. На базе выявленных SNP были разработаны и созданы чипы различной плотности для полногеномной оценки племенных качеств кур. Все геномные технологии за рубежом внедрены в практику племенного птицеводства. В нашей стране селекционный процесс ведется не достаточно интенсивно и не опирается на результаты высокотехнологичных генетических исследований. Лишь в последнее время в России стали активно вести исследования генетического полиморфизма, ассоциированного с продуктивными качествами птицы отечественных пород (Зиновьева и др., 2016).
-
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении двух однонуклеотидных полиморфизмов в гене миостатина MSTN (MST2109 и MST2244) и indel-полиморфизма в генах пролактина PRL и рецептора D2 дофамина DRD2 у кур разного типа направления продуктивности и выявлении значимых ассоциаций генов-кандидатов с показателями живой
массы птиц (среднесуточные привесы и живая масса в возрасте 7, 49 и 110 дней у кур генофондных пород и в 7 и 33 дня – у промышленного кросса бройлеров). Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
-
Разработать тест-системы анализа генетического полиморфизма в генах пролактина PRL, рецептора D2 дофамина DRD2 и оптимизировать ранее разработанную тест-систему для гена миостатина MSTN (MST2109 и MST2244), связанных с формированием мясной продуктивности кур.
-
Выполнить анализ популяционно-генетических параметров у изучаемых групп кур.
-
Изучить влияние значимых ассоциаций аллельных вариантов генетического полиморфизма генов-кандидатов миостатина MSTN (MST2109 и MST2244), пролактина PRL и D2 дофамина DRD2 на живую массу кур различного направления продуктивности.
-
Рассчитать среднесуточные привесы и изучить их зависимость от аллельных вариантов генетического полиморфизма генов-кандидатов миостатина MSTN (MST2109 и MST2244), пролактина PRL и D2 дофамина DRD2
Провести сравнительные исследования изучаемых генов-кандидатов на различных породных группах кур в зависимости от направления продуктивности.
1.4 Научная новизна. Впервые обнаружено увеличение показателей живой массы (7,7%) у петушков юрловской голосистой породы с генотипом MST2244 (G2G2) гена миостатина в возрасте 110 дней (P< 0,01). Наибольшие различия в 110 дней по живой массе у кур пушкинской породы с мутацией MST2109 гена миостатина наблюдали у особей с генотипом АА по сравнению с генотипом СС (9,4% при P < 0,01). Выявлено существенное смещение частот встречаемости аллелей по indel-полиморфизму генов рецептора D2 дофамина и гена пролактина в зависимости от яичного или мясного направления продуктивности кур. При исследовании indel-полиморфизма наибольший эффект увеличения показателей живой массы (12%) наблюдали между особями с генотипами ID (инсерция-делеция) и II (инсерция-инсерция) гене рецептора D2 дофамина у петушков пушкинской породы в возрасте 110 дней (P < 0,05). По мутации indel в гене пролактина наибольшее различие по живой массе (7,9% при P < 0,05) выявлено у курочек юрловской голосистой породы в возрасте 49 дней между особями с генотипами DD (делеция-делеция) и II (инсерция-инсерция).
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные
исследования с целью поиска молекулярно-генетических маркеров и
установления связи вариантов генетического полиморфизма с мясной
продуктивностью кур позволили выявить влияние генетических мутаций в
генах рецептора D2 дофамина, пролактина и миостатина, отвечающих за
формирование мышечной массы, на показатели живой массы кур. Полученные
результаты могут быть применены в племенных птицеводческих хозяйствах в
селекционной работе для совершенствования пород и линий кур по мясной
продуктивности.
1.6 Методология и методы исследования. В качестве основного метода
исследования использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) со
специфическими праймерами и режимами для каждого варианта генетического
полиморфизма. Амплифицированные фрагменты расщепляли с помощью
ферментов рестрикции, разделяли методом электрофореза в агарозном геле,
детекцию проводили в УФ-свете, фиксировали с помощью системы гель-
документации. Результаты проведенного генотипирования были статистически
обработаны по критерию достоверности с помощью пакета анализа программы
AtteStat.
1.7 Научные положения, выносимые на защиту. В результате
проведенных исследований были сформулированы следующие положения,
которые выносятся на защиту:
-
Разработаны две тест-системы для анализа indel-полиморфизма в генах пролактина PRL и рецептора D2 дофамина DRD2;
-
Проведен анализ трех отечественных пород кур (пушкинская, юрловская голосистая и русская белая) из генофондных стад и отечественного кросса «Смена 8» породы корниш по indel-полиморфизму в генах пролактина PRL и рецептора D2 дофамина DRD2, а также по двум SNP (MST2109 и MST2244) в гене миостатина MSTN;
-
Подтверждена гипотеза о смещении равновесия частот встречаемости аллелей по изучаемым вариантам генетического полиморфизма в трех генах при узконаправленной селекции по мясному либо яичному направлению продуктивности;
-
Рассмотрена связь двух SNP в гене миостатина (MST2109 и MST2244) с показателями живой массы кур;
-
Выявлена связь indel-полиморфизма в гене пролактина и гене рецептора D2 дофамина с показателями живой массы у кур.
-
Степень достоверности и апробация научных результатов. Полученные результаты были подтверждены статистическим анализом с определением критерия достоверности. Вычисления проведены с помощью программы Excel 2003 (Microsoft Corp., Сиэтл, США), а также программы для статистического анализа данных AtteStat12.0.5. (.
-
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано восемь печатных работ: три статьи в журналах по списку ВАК РФ: «Научный журнал КубГАУ», «Естественные и технические науки», «Cytology and genetics»; статья в журнале «Генетика и разведение животных», тезисы в научных сборниках по результатам участия в конференциях.
-
Структура и объем работы. Диссертационная работа включает главы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, предложения производству и список использованной литературы. Работа содержит 124 страницы машинописного текста, 20 таблиц, 20 рисунков. Библиография включает 159 наименований, в том числе 138 на иностранных языках.
Результаты исследований были представлены и обсуждены на Международной научной-практической конференции профессорско-преподавательского состава «Научное обеспечение развития АПК в условиях импортозамещения» (Санкт-Петербург, 2016), а так же на научно-практической конфернции «Актуальные вопросы теории и практики современной биотехнологии» (Луга, 2015), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы развития и научное обеспечение агропромышленного комплекса Северо-Восточных регионов Европейской части России» (Сыктывкар 2015) и на годичных отчетных заседаниях Ученого Совета ФГБНУ ВНИИГРЖ 2007-2016 г.г.
Полиморфные варианты гена миостатина у сельскохозяйственных животных и птиц
Изучение биохимических и генетических факторов, являющихся основой выраженного полиморфизма росто-весовых признаков, характерного для всех видов позвоночных, привело к выявлению механизмов молекулярно-генетической детерминации процессов онтогенеза (Olson, 1990). Были открыты гены гормонов (Phillips et al, 1998) и их рецепторы, а так же специальные факторы роста (Le Roith et al., 2001), оказывающие непосредственное влияние на формирование осевого скелета и мышечной ткани (Welt et al., 2002).
Ген миостатина, как один из регуляторных факторов роста, был обнаружен сравнительно недавно, в 1997 году (Nishi et al., 2002). В настоящее время опубликовано большое количество научных работ, посвященных изучению миостатина (Ferrell et al., 1999), структуре и функциональным особенностям гена миостатина (Lee et al., 2001), а так же механизмов его биологической активности в организме (Langley et al., 2002). Сразу было выявлено, что миостатин является отрицательным регулятором, т.е. ингибирует рост и развитие тканей мышц высших позвоночных (Grobet et al., 1997). Миостатин негативно регулирует активацию клеток-сателлитов, которые стимулируют послеродовой рост мышц у животных (McCroskery et al., 2003). Кроме того, выявлено, что миостатин ингибирует синтез различных мышечных белков, в том числе и сократительных, вследствие чего формирование и развитие скелетных мышц значительно замедляется. Таким образом, продуцируемый мышцами миостатин, является специфичным физиологическим регулятором их роста (Kocamis et al, 2002). Это один из факторов регулирования и поддержания равновесия многих биохимических процессов (Kawada et al., 2001), обеспечивающих синтез и обмен белков (Nishi et al., 2002) и связанные с этим процессы роста и развития скелетных мышц (Glass, 2003). Миостатин относится к группе так называемых трансформирующих факторов роста (TGF ) (Lee et al., 2001). Это одна из наиболее важных групп ростовых факторов (McPherron et al., 1999). Миостатин имеет ряд особенностей, свойственных семейству TGF : в N-концевом участке молекулы он имеет короткую сигнальную последовательность обеспечивающую секрецию белка из клетки непосредственно в кровоток, имеет специфический участок в С-концевой части в виде девяти остатков цистеина, а так же специальный внутримолекулярный сайт для процессинга (McPherron et al., 1997a). Кроме того, С-концевая область обладает высокой степенью гомологии между всеми ростовыми факторами семейства TGF и с белками участвующими в процессах формирования костной ткани. Белок миостатин имеет название фактор TGF 8 (McPherron et al., 1997b).
Особо следует отметить, что блокировка процесса биосинтеза белка миостатином и его поступления к клеткам-мишеням, имеющих соответствующие рецепторы, приводит к выраженным позитивным эффектам в процессах метаболизма клеток мускулатуры. Так различные варианты мутаций в гене миостатина приводят к заметному увеличению мышечной массы у различных видов позвоночных (Шишкин, 2004), в том числе и человека (Schuelke et al., 2004).
Одной из важнейших особенностей гена миостатина является его тканеспецифичный эффект. Исследования показали, что мРНК, образующаяся в процессе экспрессии гена миостатина, детектируется только в поперечнополосатой мышечной ткани скелетных мышц (Gonzalez-Cadavid et al., 1998) и не обнаруживается ни в гладкой мускулатуре таких органов как мочевой пузырь, матка, желудок, кишечник, ни в сердечной мышце (Thomas et al., 2000).
Секвенирование геномов многих видов животных (Zandi et al., 2013), а так же и человека, выявили присутствие гена миостатина во всех исследованных геномах высших млекопитающих, а так же и у птиц. Секвенирование данного гена показало, что различия в его строении у разных видов животных минимальны, структура гена миостатина характеризуется высоким подобием. Особо важная для функционирования регуляторных белков, в том числе и миостатина, консервативная С-концевая область является практически идентичной у всех изученных видов животных (Lee et al., 2001).
У кур ген миостатина в своем составе имеет три экзона и два интрона. Первый экзон состоит из 373 пар нуклеотидов, второй из 374 пар и третий имеет в своем составе 1567 пар нуклеотидов (Baron et al., 2002).
Особое значение для практических целей имеют исследования, направленные на выявление функционального значения миостатина. Эксперименты, проведенные на мышах показали, что особи с дефектным геном миостатина имеют существенно большую массу тела (до 135%), причем это происходило только за счет увеличения массы скелетных мышц. У некоторых гомозигот по дефекту в гене миостатина вес отдельных мышц был более чем в 2 раза больше веса тех же мышц контрольных животных. Было обнаружено значительное увеличение поперечного сечения миофибрилл у особей с дефектным геном миостатина, что характерно для мышечной гипертрофии (McPherron et al., 1999).
Есть исследовательские работы, направленные на изучение влияния миостатина на мышечную массу у свиней. В результате исследований выявлено, что избыточная экспрессия миостатина может снижать рост скелетных мышц у свиней (Chano et al., 2002).
У человека мутация в гене миостатина, ведущая к потери функциональных свойств миостатина приводит к увеличению мышечной массы и силовых качеств у детей (Escobar et al., 2004).
Были проведены исследования структуры гена миостатина у мясных пород скота, имеющих особо развитую мышечную систему. К таким породам относятся Belgian Blue, Asturiana de los Valles и Piedmontese, имеющие характерный фенотип «Double muscling», известные с XIX века и в настоящее время являющиеся узкоспециализированными мясными породами. Мышечная масса телят этих пород при рождении уже заметно выше по сравнению с телятами других пород. При этом процент костей и жировой ткани снижен (Arthur, 1995). Взрослые животные с фенотипом «Double muscling» имеют ярко выраженное увеличение мышечной массы скелетной мускулатуры (более чем на 20% по сравнению с животными других пород). В основном это происходит вследствие гиперплазии – увеличения количества и поперечного сечения мышечных волокон (Grobet et al., 1997; McPherron et al., 1997; Kocamis et al., 2002). Анализ гена миостатина у животных породы Belgian Blue выявил делецию 11 нуклеотидов экзона 3 в позиции 937-947, которая приводит к сдвигу рамки считывания на функционально важном участке, кодирующем зрелый миостатин. Более того, все животные этой породы являются гомозиготами по этой мутации, то есть не способными синтезировать миостатин (Kambadur et al., 1997). Также многие исследования показали, что не только делеции, но и некоторые из одиночных нуклеотидных замен, выявленных в гене миостатина, в некоторых случаях имеют взаимосвязь с продуктивными качествами, такими как скорость роста, качество мяса и репродукция (Grobet et al., 1998).
Было выявлено, что одиночный нуклеотидный полиморфизм имеет взаимосвязь с продуктивными качествами и у кур отечественных пород (Митрофанова и др., 2014; Митрофанова и др., 2015b). Такие SNP были обнаружены как в кодирующей области гена миостатина кур, так и в регуляторной. Так, в регуляторной области было выявлено три SNP, отличающиеся частотами аллелей у разных пород (Zhiliang et al., 2004). При этом обнаружено, что при скрещивании шелковистых кур и бройлеров в F2 гомозиготы с генотипами АА и ВВ обладают большей массой брюшного жира, по сравнению с генотипом AB. В исследованиях было выявлено три SNP в 5 регуляторной области и два полиморфизма в 3 регуляторном регионе (Gu et al., 2004).
Проводятся исследования с целью поиска SNP в кодирующей части гена миостатина и выявления их связи с продуктивными признаками (Ye et al., 2007; Zhang et al. 2012; Hu et al., 2013). Отмечено, что ген миостатина является высоко консервативным по своей структуре у всех позвоночных животных (Karim et al., 2000), но обладает высоким уровнем полиморфизма. Так, например, у 28 европейских пород крупного рогатого скота было выявлено девятнадцать одиночных нуклеотидных замен и двадцать гаплотипов (McCroskery et al., 2003).
Оптимизация и проведение ПЦР для выявления генетического полиморфизма в генах миостатина, пролактина и рецептра D2 дофамина
При проведении генетических исследований даже стандартные методики имеют отклонения из-за погрешности оборудования, разных производителей реактивов и условий проведения ПЦР. Поэтому в каждом конкретном случае при проведении генетического анализа необходима оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции. Одна из задач представленных исследований состояла в том, чтобы подобрать наиболее оптимальные сочетания и концентрации компонентов ПЦР, а так же параметры термоциклера для каждого из изучаемых вариантов генетического полиморфизма, по которым проводилось генотипирование исследуемых популяций четырех пород кур. В процессе подбора оптимального буфера были протестированы два: «5х ПЦР-буфер blue» поставщик Интерлабсервис (производитель ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и «10х ПЦР-буфер» (Thermofisher, USA). В результате было выявлено, что оба буфера работают одинаково хорошо и дают хорошую картинку при детекции амплифицированных фрагментов на электрофорезе, а поскольку «10х ПЦР-буфер» более экономичный и имеет более низкую стоимость по сравнению с «5х ПЦР-буфер blue», то можно рекомендовать его для дальнейших исследований.
Другим немаловажным параметром при проведении ПЦР является концентрация праймеров в реакционной смеси. От этого параметра зависит качество проводимой ПЦР и детекция ее результатов на электрофорезе. Было определено, что наиболее оптимальным является количество 0,2 мкл каждого из праймеров концентрацией 5 о.е./мл на 10 мкл реакционной смеси.
Фрагменты ДНК амплифицировали с использованием амплификатора фирмы «Biorad» (США). ПЦР-амплификацию проводили в конечном объеме 10 мкл с добавлением экстрагированной геномной ДНК в количестве 0,4 мкл. Реакционная смесь состояла из следующих компонентов: 2 мкл 5х Taq-буфера (20 мМ Mg2 +), 0,2 мкл Taq-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск), 1,2 мкл смеси dNTP (2,5мМ), 0,2 мкл каждого из пары праймеров и 5,8 мкл бидистиллированной воды. Все компоненты смешивали в 0,5-мл пробирке. Праймеры, которые были использованы для ПЦР, представлены в таблице 1. Для каждой пары праймеров был подобран свой термоциклер (таблица 2).
Полученные амплифицированные фрагменты гена миостатина подвергали обработке ферментами рестрикции. В случае однонуклеотидной замены MST2109 использовали рестриктазу HpaI («Fermentas»), в случае замены MST2244 применялась рестриктаза HinpI («Fermentas»). В обоих случаях фермент рестрикции добавляли в пробирки с амплифицированными фрагментами в количестве 3-4 единицы активности, затем инкубировали в течение 2 ч при температуре 56С. В результате получали следующие варианты фрагментов: при замене MST2109 если в обеих цепях геномной ДНК нуклеотид G меняется на А, исчезает сайт рестрикции, получаем два одинаковых фрагмента размером 297 п.н. Если в обеих цепях замены нет – 260 и 37 п.н. Если замена произошла только в одной цепочке ДНК – мы имеем все три варианта фрагментов 297, 260 и 37 п.н. В случае однонуклеотидной замены MST2244 наблюдали следующие варианты фрагментов: если замена нуклеотида С на G присутствует в обеих цепях ДНК, нет сайта рестрикции, то мы получали два фрагмента размером 320 п.н., если замены нет, то наблюдали фрагменты размером 203 и 117 п.н., в случае гетерозиготного варианта имели все три фрагмента 320, 203 и 117 п.н.
В случае гена пролактина и гена рецептора D2 дофамина, в которых изучали другой вариант генетического полиморфизма – indel – обработка ферментами рестрикции не требовалась, поскольку наличие мутации определяли путем исключения или добавления нескольких пар нуклеотидов, за счет чего в процессе амплификации сразу синтезируются возможные варианты фрагментов.
Частота генотипов у кур разных пород.
Исследуемые популяции трех пород кур (кроме русской белой) были протестированы по двум однонуклеотидным заменам в гене миостатина МST2109 и МST2244. Для детекции аллельных вариантов по замене МST2109 использовали следующие праймеры:
- прямой 5 -AACCAATCGTCGGTTTTGAC-3 и
- обратный 5 -CGTTCTCTGTGGGCTGACTA-3 , а также эндонуклеазу рестрикции Hpa I (Msp).
Это сочетание праймеров и рестриктазы позволило выявить наличие однонуклеотидного полиморфизма в исследуемом участке гена миостатина. В результате обработки рестриктазой Hpa I амплифицированные участки гена миостатина с однонуклеотидной заменой AG и имеющие благодаря этой замене сайт рестрикции для Hpa I, выявляли на электрофореграмме (фрагмент размером 260 пар оснований (генотип G1G1)). Участки ДНК, не содержавшие данную замену, имели размер 297 пар оснований (генотип AA). Гетерозиготные особи имели оба фрагмента (генотип G1A), что можно видеть на рисунке 7.
Результаты анализа частот встречаемости аллелей и генотипов по однонуклеотидной замене МST2109 на участке гена миостатина представлены на графиках (рис. 8 и 9). Исследованная популяция кур юрловской голосистой породы имела крайне низкую частоту встречаемости аллельного варианта A (0,068). Этот аллель оказался очень редким по сравнению с аллелем G1, частота встречаемости которого составила 0,932.
У кур пушкинской породы также выявлено смещение аллельных частот в сторону увеличения частоты аллеля G1, но данный аллельный вариант не имел такого ярко выраженного преобладания как у юрловских голосистых кур и частота составила 0,683. Аллель А имел низкую частоту встречаемости – 0,317. У популяции кур породы корниш частота встречаемости аллелей смещена наоборот в сторону преобладания аллеля А и составила 0,613. Аллель G1 встречался реже (0,378) (рис.8).
В соответствии с распределением частот встречаемости аллелей гена миостатина, так же низкий уровень встречаемости имел гомозиготный генотип АА у кур пушкинской и юрловской голосистой, и составил 0,159 и 0,015, соответственно. Обе эти породы имели низкий уровень гетерозиготности по исследуемой однонуклеотидной замене МST2109. Частота встречаемости гетерозиготного генотипа AG1 была 0,317 у кур пушкинской породы и 0,106 – у юрловской голосистой.
Преобладающим был гомозиготный генотип G1G1, частота его встречаемости составила 0,879 у кур юрловской голосистой породы, у пушкинской несколько меньше – 0,524.
У кур породы корниш гомозиготный генотип G1G1, наоборот, оказался наиболее редким и имел частоту встречаемости 0,112. Генотип АА встречался чаще, чем у пушкинской и юрловской голосистой пород, а наиболее распространенным оказался гетерозиготный генотип AG1, частота встречаемости которого составила 0,550 (рис. 9).
Для генотипирования по другой однонуклеотидной замене МST2244 в гене миостатина и выявления полиморфных вариантов на данном участке гена была использована следующая пара праймеров:
- прямой 5 AGTCAGCCCACAGAGAACG-3 и
- обратный 5 -CGAAAGCAGCAGGGTTGTTA-3 , а также эндонуклеаза рестрикции Hinp I.
Такая вариация праймеров в сочетании с используемым ферментом рестрикции позволяют выявить однонуклеотидную замену CG на данном участке гена миостатина. В результате этой замены исчезает сайт рестрикции для рестриктазы Hinp I, что при детекции дает один фрагмент размером 320 пар оснований на электрофореграмме.
Если замены CG нет после обработки амплифицированного фрагмента рестриктазой, получается два фрагмента размером 203 и 117 пар оснований соответственно. Особи, имеющие гетерозиготный генотип по исследуемой однонуклеотидной замене МST2244 на участке гена миостатина, при детекции имеют все три фрагмента (320, 203 и 117 пар оснований) (рис. 10).
Результаты генотипирования популяций кур трех пород по однонуклеотидной замене МST2244 в гене миостатина представлены на графиках (рис. 11 и 12), из которых видно, что существенное смещение по частотам встречаемости аллелей выявлено у юрловской голосистой породы кур. Наибольшую частоту встречаемости имел аллель С и составила 0,876, частота встречаемости аллеля G2 была 0,124 (рис. 11).
У кур пушкинской породы и корниш смещение частот встречаемости аллелей было менее выраженным. Так у пушкинской породы наблюдали увеличение частоты встречаемости аллеля С, которая составила 0,612, аллель G2 был более редким и его частота составила 0,388. У кур породы корниш наблюдали смещение частоты встречаемости аллелей, наоборот, в сторону увеличения аллеля G2 (0,685), наиболее редким оказался аллель С с частотой встречаемости 0,315. Куры юрловской голосистой породы имели наиболее существенное смещение частот встречаемости аллелей С – 0,903, G2 – 0,097. Соответствующим образом распределились и частоты встречаемости генотипов, представленные на рис. 12
SNP MST2244 в гене миостатина MSTN
Было изучено влияние другого одиночного нуклеотидного полиморфизма (SNP) в гене миостатина (MST2244) на показатели живой массы кур пород корниш, пушкинской и юрловской голосистой.
У юрловской голосистой породы петухи, имеющие гомозиготный генотип G2G2 заметно превосходили по живой массе своих сверстников с генотипами СG2 и СС на протяжении всего периода роста и развития (в возрасте 7, 49 и 110 дней), так же наблюдали разницу показателей и со средним показателем по стаду (таб. 8). При этом уровень достоверности разницы в 7 дней между генотипами G2G2 и CG2 был P 0,05; между генотипами G2G2 и СС, а так же между генотипом G2G2 и средним по стаду – P 0,01. В возрасте 49 дней достоверность различия по живой массе между генотипами G2G2 и СС, а также между генотипом G2G2 и средним по стаду имела самый высокий уровень (P 0,001). А между генотипами G2G2 и СG2 уровень достоверности различия был P 0,01. В 110 дней петушки юрловской голосистой породы имеющие генотип G2G2 также значимо превосходили по живой массе своих сверстников с генотипами СG2 и G2G2. Уровень достоверности различия между генотипами G2G2 и СС и генотипом G2G2 и средним по стаду – P 0,01. А между генотипами G2G2 и СG2 значение уровня достоверности различия было P 0,05.
Курочки юрловской голосистой породы особи с генотипом G2G2 имели также повышенную живую массу в возрасте 110 дней (провести измерения массы в более раннем возрасте у кур с этим генотипом не удалось в связи их потерей), однако это различие не имело статистической достоверности, вероятно, из-за недостаточного числа особей с данным генотипом.
Достоверное различие по живой массе у курочек было выявлено между генотипами СС и CG2 в возрасте 110 дней (P 0,05).
Анализ ассоциации вариантов генетического полиморфизма по однонуклеотидной замене MST2244 в гене миостатина у курочек пушкинской породы представлен в таблице 9.
Из таблицы видно, что петушки, имеющие гомозиготный генотип G2G2 превосходили по живой массе своих сверстников только в возрасте 110 дней, однако эта разница не имела статистической достоверности. В 7 и 49 дней петушки с генотипом G2G2 имели наименьшую массу среди сверстников.
В возрасте 49 дней у петушков пушкинской породы наблюдали достоверное различие по живой массе между генотипами G2G2 и СС, при этом уровень достоверности был P 0,05.
Курочки пушкинской породы, имеющие генотип G2G2, превосходили по живой массе своих сверстниц с генотипами CG и СС в возрасте 49 и 110 дней. При этом уровень достоверности различия между гомозиготными генотипами G2G2 и СС был P 0,01. Различие между генотипами G2G2 и CG2, а так же между генотипом G2G2 и средним по стаду имело уровень достоверности P 0,05.
Курочки породы корниш кросса «Смена 8» с генотипом G2G2 так же имели превосходство по живой массе по сравнению со сверстницами в возрасте 7 и 33 дня (таб. 10).
В возрасте 33 дня наблюдали достоверную разницу между курами с гомозиготными генотипами G2G2 и СС (P 0,05). В семидневном возрасте разница между группами кур имеющими генотипы G2G2 и СС имела уровень достоверности P 0,01, а между G2G2 и СG2 – P 0,05.
Из полученных результатов следует, что одиночный нуклеотидный полиморфизм MST2244 в гене миостатина оказывает влияние на увеличение показателей живой массы у кур изученных пород. Выявлено, что наиболее желательным по данной мутации является генотип GG.
По SNP MST2244 были рассчитны среднесуточные привесы по трем породам кур (пушкинская, юрловская голосистая и корниш) в соответствии с полученными генотипами. Результаты представлены в таблице 11.
Наиболее благоприятным генотипом по величине среднесуточных привесов у всех трех пород оказался G2G2. И курочки, и петушки пушкинской и юрловской голосистой породы и курочки породы корниш с генотипом G2G2 заметно превосходили по этому показателю сверстников, причем эта разница была достоверной (P 0,05) у особей обоих полов пушкинской породы, и у курочек юрловской голосистой породы по сравнению со сверстницами (P 0,01).