Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Таксономические и филогенетические взаимосвязи видов рода Solarium L. секции Petota Dumort 7
2.1.1. Систематика видов картофеля 7
2. 1.2. Дифференциация видов картофеля по уровню плоидности и геномному составу 7
2.1.3. Центры происхождения картофеля 12
2.1.4. Систематика и происхождение культурных видов картофеля 13
2. 1. 5. Происхождение возделываемых сортов культурного картофеля 16
2. 2. Организация и функционирование геномов клеточных органелл 18
2.2.1. Строение хлоропластной ДНК высших растений 18
2.2.2. Организация пластидного генома 19
2. 2. 3. Строение митохопдриальной ДНК покрытосеменных растений 22
2. 2.4. Организация митохондриального генома высших растений 23
2. 3. Изменчивость цитоплазматических геномов у видов рода Solatium и сортов культурного картофеля S. tuberosum ssp. tuberosum 26
2.3.1. Полиморфизм пластидных геномов у видов рода Solarium 26
2. 3. 2. Полиморфизм пластидных геномов у культурного картофеля Solarium tuberosum ssp. tuberosum 31
2. 3. 3. Полиморфизм митохопдриальных геномов у сортов культурного картофеля S. tuberosum ssp. tuberosum и видов рода Solarium 32
2. 4. Межвидовая гибридизация и интрогрессия генетического материала диких видов в геном культурного картофеля 34
2.4. 1. Половая гибридизация и генетические основы скрещиваемости картофеля 35
2.4. 2. Наследование цитоплазматических органелл при половой гибридизации 36
2.4.3. Соматическая гибридизация 37
2.4. 4. Наследование клеточных органелл у межвидовых соматических гибридов картофеля 41
2. 4. 5. Наследование клеточных органелл у внутривидовых соматических гибридов картофеля 45
3. Материалы и методы
3.1. Материалы 48
3.1.1. Дикие и культурные виды рода Solarium L 48
3.1.2. Сорта культурного картофеля 51
3.1.3. Межвидовые соматические гибриды 55
3.2. Методы 56
3.2.1. ВыделениеДНК 56
3.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции 57
3.2.3. Разделение амплификационных фрагментов 59
3.2.4. Статистическая обработка результатов 59
4. Результаты и обсуждение 61
4.1. Полиморфизм цитоплазматических ДНК видов картофеля и близких неклубненосных видов рода Solanum L 61
4. 1. 1. Полиморфизм пластидных последовательностей 61
4. 1.2. Полиморфизм митохоидриальных последовательностей 65
4.1.3. Кластерный анализ 72
4. 2. Определение цитоплазматического состава аборигенных чилийских форм S. tuberosum ssp. tuberosum и селекционных сортов картофеля 76
4.2.1. Полиморфизм органельных локусов у аборигенных чилийских форм S. tuberosum ssp. tuberosum и селекционных сортов картофеля ." 77
4.2.2. Гаплотипы сортов картофеля 84
4. 3. Наследование органельной дик у межвидовых соматических гибридов 94
4. 3. 1. Характер сегрегации органелл 96
4.3.2. Динамика сегрегации различных типов органелл 101
4. 3. 3. Реорганизация органельных ДНК у соматических гибридов 103
4. 3. 4. Совместимость пластид и митохондрий разных видов в клетках гибридных растений 107
5. Заключение 114
6. Выводы 115
7. Список литературы
- Таксономические и филогенетические взаимосвязи видов рода Solarium L. секции Petota Dumort
- Изменчивость цитоплазматических геномов у видов рода Solatium и сортов культурного картофеля S. tuberosum ssp. tuberosum
- Дикие и культурные виды рода Solarium L
- Полиморфизм цитоплазматических ДНК видов картофеля и близких неклубненосных видов рода Solanum L
Введение к работе
Актуальность проблемы Наследование цитоплазматических ДНК при половой гибридизации у большинства видов растений осуществляется однородительски по материнской линии. Такой тип наследования препятствует свободному межвидовому обмену внеядерными генами и существенно ограничивает диапазон изменчивости признаков, кодируемых геномами органелл. В то же время, гены хлоропластной ДНК (хлДНК) и митохондриальной ДНК (мтДНК) участвуют в контроле таких фундаментальных биологических процессов как фотосинтез и клеточное дыхание. Под контролем внеядерных генов находится и ряд селекционно важных признаков, например, цитоплазматическая мужская стерильность и устойчивость к ряду гербицидов. При изучении аллоплазматических линий разных видов растений выявлено влияние геномов органелл на продуктивность, морфогенетические потенции, фертильность, а также на фотосинтетические и респираторные параметры (Даниленко, Давыденко, 2003).
Исследования, направленные на расширение разнообразия цитоплазматических геномов, особенно актуальны для картофеля, большинство изученных сортов которого имеет один и тот же «культурный» тип пластидной и митохондриальной ДНК (Hosaka, 1986; Powell et al., 1993; Loessl et al., 1999). Разработанные к настоящему времени методы клеточной инженерии растений, основанные на слиянии протопластов, устраняют ограничения традиционной половой гибридизации и позволяют получать цитоплазматические гетерозиготы, предоставляя возможности для комбинирования генов хл- и мтДНК разных видов (Глеба, Ситник, 1984; Waara, Glimelius, 1995; Гавриленко, 2005). Вовлечение в генетические и селекционные программы органельных генов диких видов позволяет создавать принципиально новые формы культурных растений, представляющие интерес как для фундаментальных, так и для прикладных исследований.
Цель работы заключалась в изучении межвидового и внутривидового полиморфизма ряда локусов пластидной и митохондриальной ДНК у видов рода Solanum L. секции Petota Dumort, у селекционных и аборигенных чилийских сортов картофеля, а также в анализе особенностей наследования и реорганизации геномов органелл у межвидовых соматических гибридов.
Задачи работы:
Исследовать полиморфизм ряда последовательностей хл- и мтДНК у диких и культурных видов картофеля, а также у отдельных представителей неклубненосных видов рода Solarium.
Изучить полиморфизм ряда локусов хл- и мтДНК у селекционных сортов возделываемого картофеля и аборигенных чилийских форм S. tuberosum ssp. tuberosum.
Определить особенности передачи геномов органелл соматических гибридов картофеля в зависимости от степени филогенетической близости родительских видов и от уровня их плоидности.
Изучить совместимость ядра и цитоплазмы сортов картофеля и различных диких видов рода Solarium, а также особенности реорганизации органельных геномов у межвидовых соматических гибридов.
Научная новизна Впервые проведено изучение полиморфизма последовательностей пластидного локуса trnD/trnT для 16 видов рода Solarium, а также 4-х локусов мтДНК для 13 видов. Это позволило выявить в изученных мт-локусах новые, ранее не описанные в литературе аллели. Кроме того, новые аллели были выявлены у изученных диких видов картофеля в пластидном локусе atpE. Впервые установлен низкий уровень полиморфизма последовательностей органельной ДНК у сортов картофеля отечественной селекции. Впервые на больших выборках в разных межвидовых комбинациях слияния протопластов статистически достоверно доказаны различия в характере передачи органелл родительских видов у соматических гибридов картофеля: случайное наследование для пластид и неслучайное для митохондрий. Показано отсутствие эффектов несовместимости органелл разных видов, а также эффектов ядерно-цитоплазматической несовместимости у межвидовых соматических гибридов картофеля.
Практическое значение работы При помощи ПЦР со специфичными праймерами выявлены значительные различия органельных геномов ряда видов картофеля, что позволяет рекомендовать данный метод для анализа филогенетических взаимоотношений видов и изучения гибридных линий, полученных методами отдаленной гибридизации, Проведенная нами
характеристика цитоплазматического состава сортов отечественной селекции и ряда аборигенных чилийских форм дает дополнительную информацию для генотипирования сортов картофеля и анализа их родословных. Полученные в результате скрещивания межвидовых соматических гибридов с селекционными сортами новые фертильные формы с чужеродной цитоплазмой могут быть использованы для создания аллоплазматических линий картофеля.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных научных конференциях, включая: EARP/EUCARPIA Олу, Финляндия, 2003; «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 2004; EARP, Бильбао, Испания, 2005; на III съезде ВОГиС, Москва, 2004; на 14-й конференции FESPB, Краков, Польша, 2004; на 5 Международном совещании по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений, С.Петербург, 2005.
Публикации. По результатам работы опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи, 1 статья отослана в печать.
Объем и структура работы Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы, приложение. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включает 26 рисунков и 16 таблиц. Список литературы включает 237 наименований.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 05-04-49259).
Благодарности Автор выражает сердечную признательность своему научному руководителю д. б. н. Т. А. Гавриленко за инициацию данных исследований, научное руководство и всемерную поддержку работы. Глубокую признательность за помощь в работе автор выражает д.б.н. Л. И. Костиной, д.б.н. С. Д. Киру, к.б.н. Г. И. Пендинен, а также всему коллективу отдела биотехнологии. Автор благодарит за сотрудничество своих соавторов R. Thieme (BAZ, Германия) и А. Щербакову (ПАН). Автор благодарит за поддержку Российский Фонд Фундаментальных Исследований (РФФИ) и Программу двустороннего российско-немецкого сотрудничества, оказавшую помощь в исследованиях соматических гибридов.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Таксономические и филогенетические взаимосвязи видов рода Solarium L. секции Petota Dumort
Основной особенностью видообразования в секции Petota рода Solarium является наличие полиплоидных рядов от 2х до 6х. Эти ряды были выявлены еще в тридцатых годах прошлого века (Рыбин, 1933). Большинство видов картофеля (74%) являются диплоидами (2п = 2х = 24). Тетраплоидные виды (2n = 4х = 48) составляют 15%, гексаплоиды (2п = 6х = 72) - около 5%, и примерно 6% составляют виды с нечетными уровнями плоидности: триплоиды (2п = Зх = 36) и пентаплоиды (2n =5х = 60) (Hawkes, 1990; 1994). 11 серий секции Petota включают только диплоидные виды, 3 серии охватывают только полиплоидные, в 7 серий входят как диплоидные, так и полиплоидные виды (таблица 1).
Среди полиплоидных видов картофеля можно встретить примеры природной авто- и аллополиплоидии. Например, дикорастущие виды S. acaule, S. stoloniferum и S. oplocense являются аллотетраплоидами, а виды S. demissum и S. albicans - аллогексаплоидами. Однако природа большинства полиплоидных видов (авто- или аллополиплоидия) до сих пор не установлена. Это связано прежде всего с трудностями проведения цитогенетических исследований видов картофеля. Отличительной особенностью видов рода Solarium являются небольшие размеры хромосом (1 - 3,5 \ж) и низкий уровень их кариотипической дифференциации (Swaminathan, 1954; Koopmans, 1951), что существенно осложняет исследования геномного состава различных видов картофеля. До сих пор идут споры о характере плоидности культурного картофеля S. tuberosum. По мнению Матсубаяши (1991) культурный картофель является сегментным аллотетраплоидом. В то же время, ряд авторов считает его автотетраплоидом (Swaminathan, 1954; Howard, 1961).
На основании изучения конъюгации хромосом видов и межвидовых гибридов, а также фертильности/стерилыюсти их пыльцы была сформулирована гипотеза геномной дифференциации видов секции Petota (Matsubayashi, 1991; таблица 1). Матсубаяши различает у картофеля пять геномов: А, В, С, D, и Е. Ядерный геном А выявлен у всех клубнеобразующих видов картофеля, причем геномы видов разных серий различаются незначительными криптическими модификациями, обозначаемыми индексами, соответствующими названиям серий. Например, виды серии Pinnatisecta имеют геном Api , виды серии Bulbocastana - геном Аь, серии Morelliformia - Am и, наконец, серии Tuberosa -А1. Геном В входит в состав геномов аллотетраплоидов серии Longipedicellata (ААВВ), геном С - в состав геномов аллотетраплоидов серии Conicibaccata (ААСС). Геном D Матсубаяши выявлял у аллогексаплоидных мексиканских видов серии Demissa (AADDDjD]) (Matsubayashi, 1991). Другие исследователи также считают, что различия между модификациями А-генома южноамериканских клубненосных видов незначительны, но обозначают их цифровыми индексами (Hawkes, 1994). Согласно Хоксу, мексиканские диплоидные виды обладают геномом В (Hawkes, 1958, 1990; Spooner et al., 1992).
Все авторы признают наличие у неклубненосных видов картофеля серии Etuberosa дифференцированного генома Е, впервые выявленного в работе Ramanna и Hermsen (1982). Геном Е отличается от генома А по структурным перестройкам хромосом (Ramanna, Hermsen, 1981, 1982; Perez et al., 1999).
Для изучения филогенетических отношений между видами картофеля наряду с цитогенетическими применяют также молекулярные методы: ПДРФ-, AFLP- и SSR- анализы ядерной ДНК, секвенирование последовательностей уникальных генов (Bonierbale et al., 1988; Debener et al., 1990; Ghislain et al., 2001; Spooner et al., 2005a; Peralta, Spooner, 2001) и анализ полиморфизма ДНК органелл (Hosaka et al., 1984; Hosaka, 1995). Например, анализ совместной сегрегации ПДРФ-, RAPD- и AFLP-маркеров позволил построить подробные карты хромосом Е-генома и локализовать на них места транслокаций по сравнению с геномом A (Perez et al., 1999).
Центром видообразования рода Solarium L. является Американский континент. Как и вопросы систематики, проблема центров происхождения картофеля трактуется неоднозначно. Выделяют три центра наибольшей концентрации видового разнообразия (Букасов, 1971,1978; Будин, 1986; Синская, 1969, Горбатенко 1990): 1) Горные Андийские области с прилегающими к ним предгорьями и равнинами, Перу, Боливия и Аргентина. 2) Чили и остров Чилое. 3) Центральная Америка, Мексика.
Самое большое число видов картофеля обнаружено в Перу - 93 вида, или 47% от общего количества. В Боливии и Мексике найдено более 30 видов, примерно 30 - в Аргентине, менее 20 в Эквадоре и Колумбии. Гораздо меньшее число видов (менее 10) описано в Гватемале, а также в Чили, Бразилии, США, Венесуэле, Панаме, Парагвае и Уругвае, по одному виду - в Коста-Рике и Гондурасе (Huaman, Spooner, 2002). Естественно, что начало окультуривания картофеля также связано с центрами его видового разнообразия. Самые ранние доказательства этого процесса были найдены в центральном Перу (Hawkes, 1990), их возраст датируют 7-Ю тысяч лет до н. э..
Вопросы таксономии, происхождения и взаимосвязей культурных и дикорастущих видов являются наиболее сложными в систематике и филогении картофеля. Таксономия культурных видов крайне противоречива и вызывает большие разногласия у ведущих систематиков картофеля. Так, Букасов (1978) выделял 21 вид культурного картофеля (таблица 2), объединяя их в 3 серии. Хокс выделяет 7 видов культурного картофеля (Hawkes, 1990), относя все эти виды к серии Tuberosa (cult.) (таблица 1, 2). По классификации Добса (Dobbs, 1962) все возделываемые виды (за исключением S. xjuzepczukii Buk. wS.x curtilobum Juz. et Buk.) объединены в один вид S. tuberosum, разделенный на 4 культивара: Tuberosa, Andigenum, Stenotomum и Phureja. И, наконец, Спунер предлагает объединить все культурные виды картофеля в 7 подвидов, которые он относит в категорию одного вида-5". tuberosum (Huaman and Spooner, 2002).
На сегодняшний день европейские и американские ученые (IPK, SCRI, CIP, NRSP-N) следуют систематике Хокса, так как она в определенной степени совпадает с результатами современных исследований по молекулярной филогении (Hosaka et al,1984; Spooner et al, 1991, 1992, 1993), а также с данными традиционных исследований по скрещиваемости, геномным исследованиям и эколого-географической и морфобиологической дифференциации видов. Необходимо отметить, что большинство российских ученых придерживаются традиционной систематики С. М. Букасова (Букасов, 1971, 1978).
Изменчивость цитоплазматических геномов у видов рода Solatium и сортов культурного картофеля S. tuberosum ssp. tuberosum
Полиморфизм органельных ДНК картофеля и других видов семейства пасленовых является объектом многочисленных исследований на протяжении последних 20 лет. Полученные результаты используются для уточнения филогенетических отношений внутри семейства Solanaceae (Olmstead, Palmer, 1992) и, в частности, между видами рода Solarium (Hosaka et al., 1984; Hosaka, 1986; Spooner et al., 1993; Spooner et al., 2005b; Sukhotu et al., 2005), а также для изучения особенностей ядерно-цитоплазматических взаимодействий и влияния их на определенные хозяйственно-ценные признаки (Lossl et al., 1994, 2000).
У картофеля, как и у многих других культур, уровень изученности пластидных геномов значительно выше, чем митохондриальных. Это объясняется несколькими причинами. Во-первых, до недавнего времени анализ мтДНК являлся гораздо более трудоемким. Имеющая небольшие размеры хлоропластная ДНК могла быть исследована непосредственно при помощи рестрикционного анализа, в то время как анализ мтДНК требовал предварительного клонирования генов с созданием на их основе зондов для блот-гибридизации (Lossl., 1995). Только разработка STS-маркеров, специфичных для каждого вида ДНК органелл (Lossl et al., 1999; Bastia et al., 2001) позволила сделать анализ хл- и мтДНК одинаково эффективным. Во-вторых, являясь более стабильной и менее подверженной рекомбинациям, хлДНК позволяет регистрировать действительно значимые события в процессах возникновения и дивергенции видов. Полиморфизм же митохондриальных последовательностей часто является избыточным в силу присущей мтДНК способности к рекомбинации.
Полиморфизм пластидных геномов у видов рода Solanum
Первые работы по изучению хлоропластной ДНК различных диких и культурных видов картофеля были осуществлены при помощи метода рестрикционного анализа еще в середине 80-х годов прошлого века (Hosaka et al., 1984; Hosaka, 1986). Использование восьми ферментов рестрикции позволило выявить значительный полиморфизм последовательностей хлДНК у разных видов картофеля и томатов и затем объединить эти виды в 4 кластера (Hosaka et al., 1984): 1) Южноамериканские клубнеобразующие виды и диплоидный мексиканский вид S. verrucosum (обладающие ядерным геномом А), а также аллополиплоиды Мексики и Центральной Америки, в состав компонентных геномов которых также входит геном А; 2) Диплоидные мексиканские виды (за исключением S. verrucosum) серий Bulbocastana, Pinnatisecta и Polyadenia, обладающие, согласно Хоксу, ядерным геномом В; 3) Неклубненосные южноамериканские виды серии Etuberosa, имеющие ядерный геном Е. 4) Неклубненосные южноамериканские виды серии Juglandifolia, образовавшие общий кластер с видами рода Lycopersicon.
Наиболее обособленное положение занимали кластеры 3 и 4, то есть неклубненосные виды подсекции Estolonifera. Это хорошо согласовывалось с данными по скрещиваемости видов. Показано, что половая гибридизация представителей серии Etuberosa возможна только с дикорастущими видами серий Pinnatisecta (Ramanna, Hermsen, 1982), а виды серии Juglandifolia вообще не скрещиваются с другими видами картофеля, но способны образовывать половые гибриды с томатами (Rick, 1951).
В дальнейшем при помощи рестрикционного анализа хлДНК у картофеля были выделены пять основных типов пластидных геномов - W, С, S, А и Т - а также несколько минорных (Hosaka, 1986). Исходным, наиболее примитивным типом хлДНК автор посчитал тип W (wild), выявленный у диких диплоидных видов серий Yungasensa и Demissa , а также у многих диких видов серии Tuberosa (wild). Относительно этого типа в дальнейшем определяли число и направление мутаций других типов хлоропластных геномов. Большинство типов хлДНК отличались от исходного типа W мутациями в одном или двух рестрикционных сайтах (таблица 3). В противоположность этому, изменения хлДНК Т- типа затрагивали сайты всех изученных рестриктаз (таблица 3). При помощи блот-гибридизации было показано, что появление хлДНК этого типа связано с делецией размером 241 п. о. (Hosaka et al., 1988).
В дальнейшем, при расширении числа изучаемых образцов, для многих видов стал очевиден полиморфизм типов хлДНК. Так, у диплоидного культурного вида S. multidissectum были выявлены образцы с хлоропластными геномами С, S и минорным вариантом С . Недавно у дикого вида S. tarijense (серия Yungasensa) был выявлен «культурный» Т- тип хлДНК (Hosaka, 2003). При анализе культурных видов & stenotomum и S. tuberosum ssp. andigena было показано, что они обладают всеми основными типами хлДНК, а именно С, S, А, W и Т (Hosaka, 1986; Hosaka, 1995; Hosaka, Hanneman, 1988, Hosaka, 2003; Sukhotu et al., 2004). Частоты встречаемости типов хлДНК у S. tuberosum ssp. andigena были неодинаковы у образцов различного географического происхождения. Мексиканские и эквадорские формы этого вида обладали хлДНК исключительно А- типа. Образцы из более южных областей ареала ssp. andigena обладали большим полиморфизмом хлоропластных последовательностей, что хорошо согласовывалось с данными о предполагаемом центре происхождения данного подвида (Hawkes, 1978).
Наибольшее разнообразие типов пластидных геномов свойственно культурным видам серии Tuberosa (cult.), что, вероятно, указывает на их полифилетическое происхождение. Дикие виды серии Tuberosa (wild.) являются более однородными — большинство из них содержит хлДНК типа W. Большинство диких видов других серий также имеют пластиды этого типа. Следует отметить, что пластидный состав видов многих серий секции Petota до сих пор остается неизученным (см. таблицу 1).
Классификация Хосаки применяется до настоящего времени, однако при увеличении числа применяемых рестриктаз регистрируемый полиморфизм выходит за пределы нескольких типов хл геномов. В работах Спунера (Spooner et al., 1991; Spooner, Sytsma, 1992) рестрикционный полиморфизм хлДНК был применен для изучения филогенетических отношений между мексиканскими и южно-американскими дикими видами картофеля. Были использованы 22 различных фермента, что позволило выявить 131 изменение рестрикционных сайтов. Изученные 35 видов по результатам кластерного анализа разделились на 3 группы: (1) мексиканские диплоидные виды серий Morelliformia, Pinnatisecta и Polyadenia (за исключением S. cardiophyllum), (2) S. bulbocastanum и S. cardiophyllum, (3) мексиканские полиплоидные виды серий Demissa и Longipedicellata, южно-американские виды различных уровней плоидности, а также мексиканский диплоидный вид серии Tuberosa S. verrucosum. Было отмечено, что совместная кластеризация S. verrucosum и полиплоидных мексиканских видов серии Demissa хорошо совпадает с данными по скрещиваемости (Spooner, Sytsma, 1992). Генетическая общность мексиканских диплоидных видов (за исключением S. verrucosum) и отличие их от диплоидных видов южно-американского происхождения были подтверждены и в дальнейших исследованиях хлДНК с привлечением большего числа анализируемых видов и образцов (Spooner, Castillo, 1997).
Дикие и культурные виды рода Solarium L
Объектом исследования послужили виды картофеля, относящиеся к 13-ти сериям секции Petota. Многие виды были представлены несколькими образцами. Всего было изучено 67 образцов 23-х диких и 6-ти культурных видов картофеля, а также по одному образцу видов S. nigrum и S. caripense - представителей отдаленных секций Basarthrum и Solanum. В анализ был включен ряд видов, пластидный состав которых был уже изучен Хосакой при помощи рестрикционного анализа, что обеспечило возможность сравнения результатов. Информация об изученных видах приведена в таблице 5; классификация и геномный состав видов даны согласно Хоксу (Hawkes, 1990).
В работе были исследованы 20 аборигенных чилийских сортов S. tuberosum ssp. tuberosum (в дальнейшем - tbr) и 98 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции из коллекций ВИР и Генбанка GLSK (Германия). Проанализированные чилийские формы представляли 14 разных сортотипов, выделенных на основании полиморфизма морфологических признаков (Костина, 1988). Среди селекционных сортов были проанализированы как современные, так и стародавние сорта, представляющие различные группы интродукции картофеля (Костина, 1992). Ряд этих сортов, таких как Early Rose, Flourball, Victoria Patersona, Reichskanzler и другие, послужил началом десяткам и сотням современных сортов, в том числе отечественной селекции. Например, насчитывается более тысячи потомков сорта Early Rose и около пятисот потомков сорта Victoria Patersona (Костина, 1992). В группу образцов отечественной селекции (Россия и республики бывшего СССР) вошли многие сорта, включенные в «Государственный реестр сортов и селекционных достижений Российской Федерации», а также ряд стародавних сортов, активно используемых в селекционных программах (Лорх, Комсомолец 20 и другие). Список изученных сортов приведен в таблице 6.
Растения межвидовых соматических гибридов были получены и идентифицированы при помощи RAPD- и ядерных SSR-маркеров, методов цитофотометрического и, в некоторых комбинациях, GISH анализа (Thieme et al., 2003; Gavrilenko et al., 2002, 2003) в совместных исследованиях с доктором Р. Тиме (BAZ, Германия). Гибриды картофеля и S. nigrum были любезно предоставлена доктором А. Щербаковой (Институт биохимии и биофизики ПАН, Польша) (Szczerbakowa et al., 2001).
Всего в работе было проанализировано 413 соматических гибридов в 10-ти разных комбинациях слияния протопластов (таблица 7). Большинство межвидовых гибридов были получены с участием одних и тех же сортов, что позволило провести сравнительное изучение ядерно-цитоплазматических взаимодействий в разных комбинациях слияния протопластов.
Тотальную ДНК выделяли из листьев полевых или in vitro- растений с использованием 2-х различных методов.
В большинстве случаев использовали методику Винанда и Файкса (Wienand, Feix, 1980) с некоторыми модификациями:
Навеску листьев растирали в жидком азоте, переносили в пробирки с экстракционным буфером (50 тМ трис-HCl, рН 8.0; 100 mM NaCl; 50тМ ЭДТА; 0,5% саркозин, 1% поливинилпирролидон) и экстрагировали при комнатной температуре в течение 2 часов. К образовавшемуся раствору ДНК добавляли равный объем смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1) и обрабатывали, инвертируя пробирки в течение 1 часа при комнатной температуре. Полученную эмульсию разделяли центрифугированием в течение 15 минут при ЗОООоб/мин.
Водную фазу, содержащую раствор ДНК, отбирали в чистые пробирки и добавляли к ней раствор метабисульфита калия до конечной концентрации 1,4 %. Раствор ДНК вновь обрабатывали смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) в течение 30 минут и центрифугировали в течение 15 минут при ЗОООоб/мин.
К отобранной водной фазе добавляли 2,5 объема 96% этанола, предварительно охлажденного до -20 С. Осадок формировали при - 20 С в течение ночи, затем собрали центрифугированием, промывали в 80% этаноле, высушивали и растворяли в буфере ТЕ (10 тМ трис-HCl, рН 8,0; 1 тМ ЭДТА).
В случае необходимости полученный раствор несколько раз обрабатывали поливинилполипирролидоном для избавления от полифенольных соединений. Затем ДНК переосаждали при помощи 0,4 % СТАВ в присутствии 0,5 М NaCl. Осадок собирали центрифугированием при 15 000 об/мин, промывали 3 раза в 80% этаноле, высушивали и окончательно растворяли в буфере ТЕ.
Тотальная ДНК соматических гибридов и ряда сортов была выделена при помощи набора фирмы Invitek согласно инструкции фирмы-изготовителя.
Качество полученных препаратов контролировали спектрофотометрически и электрофорезом в 0,8% агарозном геле. Все полученные препараты имели хорошие спектральные характеристики (А26(/ A2so 2.0; А260/ А2зо 1.8 ).
Полиморфизм цитоплазматических ДНК видов картофеля и близких неклубненосных видов рода Solanum L
Пара праймеров ALC_1/ ALC_3 маркирует пластидный локус atpE, в области которого хлДНК «культурного» Т-типа содержит делецию размером 241 п.о. ПЦР с данными праймерами позволяет отличать хлДНК Т-типа от всех остальных и, в частности, от типа W. Согласно литературным данным, хлДНК W-типа при амплификации должна образовывать фрагмент размером 622 п.о., а хлДНК Т-типа - 381 п.о. (Loessl et al., 2000).
Электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК с праймерами ALC_1/ALC_3 в агарозных гелях выявило у исследованных видов два типа фрагментов - размерами примерно 380 и 620 п.о. Было установлено, что хлДНК Т-типа (380 п.о., аллель 1) имели один образец S. tarijense и один образец S. tuberosum ssp. andigena. У остальных 66 образцов в агарозных гелях ПЦР-продукты демонстрировали одинаковую подвижность, соответствующую «дикому» W-типу (около 620 п.о.). Однако при электрофорезе в 6% неденатурирующем ПААГ нам удалось разделить их на 3 типа фрагментов, обозначенные от меньшего к большему как аллели W(2), W(3) и W(4) (рисунок 4). При этом у большинства культурных и диких видов картофеля и у сортов подвида tuberosum была выявлена аллель W(4) (таблица 9). Новые, не описанные ранее аллели W(2) и W(3) обнаружены в основном у отдаленных видов секций Solatium и Basarthrum и серий Pinnatisecta, Bulbocastana, Juglandifolia, Etuberosa (таблица 9).
Полиморфизм хлДНК по локусу trnG/trnR (праймер NTCP9)
Пара праймеров NTCP9 фланкирует хлоропластный микросателлитный повтор СП о), расположенный в межгенном спейсере trnG/trnR. У картофеля полиморфизм этого локуса связан не только с изменением числа нуклеотидов внутри самого микросателлитного повтора, но и с тандемными дупликациями некоторых участков (9 или 30 п.о.), которые у других пасленовых (N. tabacum) являются уникальными. Поэтому виды и сорта картофеля по этому локусу обнаруживают высокую степень полиморфизма (Bryan et al., 1999).
Электрофоретическое разделение продуктов амплификации с праймером NTCP9 мы проводили в 5% ПААГ при денатурирующих условиях. У изученных образцов видов рода Solarium в локусе trnG/trnR нами было выявлено 8 различных аллелей (рисунок 5), что соответствовало литературным данным (Bryan et al., 1999). Аллели 1 - 4, соответствующие фрагментам меньших размеров, были обнаружены только у неклубненосных видов серий Etuberosa и Juglandifolia и секций Basarthrum и Solarium. Для диких и культурных видов картофеля были характерны аллели 5 - 8. У ряда видов - S. spegazzinii, S. demissum и S. tuberosum ssp. andigena - были выявлены различия между изученными образцами (таблица 9).
Полиморфизм хлДНК по локусу trnP/trnT(праймер рисВ)
Пара праймеров trnD/trnT, обозначаемая сокращенно рисВ, относится к числу универсальных праймеров, способных детектировать полиморфизм некодирующих районов хлоропластных ДНК растений (Demesure et al., 1995). Они были опробованы на нескольких (4) видах картофеля, и было показано, что с помощью этих праймеров можно различать виды кластеров Е- и А- геномов (Bastia et al., 2001).
У всех изученных нами видов картофеля подсекции Potatoe и у неклубненосного вида S. rickii продукты ПЦР с праймером рисВ имели один и тот же размер (800 п.о., аллель 1). У неклубненосных видов серии Etuberosa и секций Basarthrum и Solarium образовывался фрагмент размером около 1200 п.о. (аллель 2) (рисунок 6, таблица 9).
ПЦР с праймерами ALM_4/ ALM5 позволяет различать у сортов культурного картофеля S. tuberosum ssp. tuberosum 3 типа мтДНК: а, р и у. Размер амплифицированного фрагмента d типа должен составлять 2,4 т.п.о., (З типа - 1,6 т.п.о., а в случае мтДНК у-типа амплификации не происходит (Loessl et al., 2000).
Использование этих праймеров для анализа мтДНК 31 вида рода Solarium позволило нам выявить девять различных аллелей локуса rpslO (рисунок 7, таблица 9). Три из них соответствовали аллелям d, (3 и у. Митохондриальная ДНК d типа (по нашей классификации аллель 8) была обнаружена у 13-ти образцов пяти диких видов (таблица 9). У вида S. vernei была выявлена нулевая аллель, что соответствовало у-типу мтДНК. Большинство образцов (47 из 61 изученного), представляющие 20 различных видов, обладали мтДНК «культурного» р-типа (в нашей классификации - аллель 6).
Остальные аллели локуса rpslO были выявлены нами впервые у отдаленных видов серий Juglandifolia, Bulbocastana, Pinnatisecta и Commersoniana, а также секций Solarium и Basarthrum (рисунок 7, таблица 9).
Р -тип мтДНК называется в литературе «культурным», поскольку им обладали большинство изученных Лосслем сортов картофеля. В наших исследованиях аллель 6 (или Р- тип мтДНК) оказалась наиболее распространена не только среди культурных, но и среди диких видов картофеля (таблица 9). Следует отметить, что мт геномы двух образцов S. chacoense, двух образцов S. acaule и всех изученных образцов S. demissum содержали аллели 6 и 8 одновременно.
В ряде случаев (S. acaule, S. chacoense и S. tuberosum ssp. andigend) изученные образцы одного вида имели разные аллели локуса rpslO (таблица 9).
Полиморфизм мтДНК по локусу atp6 (праймсры AL Mt2/ALM 3)
Данная пара праймеров маркирует дополнительную копию участка мт генома, содержащего локус atp6. Дуплицированная копия отличается от исходного гена участком протяженностью 211 п.о., расположенным сразу за терминирующим кодоном. У сортов картофеля ssp. tuberosum дополнительный локус atp6 (ПЦР- продукт размером 623 п.о.) был обнаружен в мт геномах «диких» типов а и у, но отсутствовал в мтДНК «культурного» Р- типа (аллель 0) (Loessl et al., 1999).
Митохондриальные геномы подавляющего большинства проанализированных в нашей работе диких видов имели нулевую аллель локуса аїрб (отсутствие продуктов реакции было подтверждено в трех независимых экспериментах). Аллель 1, соответствующая ПЦР- продукту размером примерно 620 п.о., была найдена только у трех образцов вида S. demissum и у двух образцов S. tuberosum ssp. andigena. У вида S. stoloniferum нами впервые была обнаружена аллель 2 -ПЦР- продукт размером около 650 п.о. (таблица 9, рисунок 8).
