Получение и характеристика кДНК копии гена, кодирующего белок семявыносящей луковицы Drosophila melanogaster Дянов, Христем Митков

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМИ В основе индивидуального развития организма лежит дифференциальная активность генов , сопровождающаяся, в частности, синтезом тканеспециФических белков . Ввиду уникальной генетической изученности дрозофилы, этот организм широко используется в качестве об-ьекта при разработке экспериментальных моделей для изучения молекулярно-генетических механизмов тканеспецифической экспрессии. Наиболее подробно изученими в этом плане явлются ген-белковые системи хориона, слюнных .ъелез и гемолимфы. Удобной экспериментальной моделью для изучения клеточной дифференцировки и тканеспецифической экспрессии ГЄЦ0В ЯЇІЛЛЄТСЯ семявыносяшая луковица (СЛ) самцов дрозофил , что отрадно в работах Л. И. Корочкина и соавторов. Белки половой системы самцов дрозофил занимают особое место среди модельных систем для анализа дифференциальной экслресии генов. Это связано с тем, что, во-первых, внутренние гениталии представлены тремя основними отделами (парагониями, передним ссшвынослщнн протоком и 'мявшюсящсй луковицей) , которые образуются из общего зачатка, но 4vko различаются по ультраструктуре слагающих их эпителиальных клеток, и специализированы для синтеза большого количества глико-протеидного секрета . Во-вторых , секреторные белки репродуктивных органов обладают необычайно высокой генетической изменчивостью и межвидовыми различиями. В-третьих, участвуя в репродуктивных процессах и обладая видоспецнфическнми свойствами, эти белки могут обеспечивать посткопулятиЕную репродуктивную изоляцию между видами дрозофил . Все это обусловливает интерес к сравнительно-видовому анализу белков репродуктивной системы . Кроме того, несколько Филогенетические отношения видов группы inelanoiraster детально исследованы, а геном вида D. melaiiow'aster подробно охарактеризовал на молекулярном уровне , эти виды представляют собой уникальную модель для сравнительного молекулярно генетического анализа и для анализа эволюционных изменений генома в группе melanogaster . На-дачи настоящею исследования щ<одт.тоьаіш логикой более и.-.много описания данной экспериментальной системы.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАВОШ. В данном исследовании проведен анализ белков одного из отделов геннталиен , сьшвиноі.'япіей .аугон мни , у представителей различных таксонов рода 1л osoplи 1 л и, в частности, группы wHaiiouarfter с целью поиска ген белковых систем, способных

. -2-

служить маркерами изменений онтогенетических программ дифференщ

ровки іслрток, возникших в йоде органе-, ткане-, и/или видообрг воваиия. Для достижения этой цели были поставлены следующие вадг ЧИ:

1. Поиск специфических белков п СЛ самцов D. nxjlenogester

2. Конструирование кДШ-бибилиотеїиі самцов D. melanogaster поиск и выделение кДШ-копий генов органо-слецифических белков.

3. Характеристика транскрипции гена органо-специфического белка ОЛ РЕРпЫ) и его сравнительное изучение in vivo.

4. Определение первичной последовательности кДНК-копия гена белка PEBmell для компьютерного сравителыюго анализа гена (тран скрипта) и его белкового продукта и для использовании этой кДНК последовательности при будущем изучени геномного гена и его регу ля НИИ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Кроме ранее описанного PEBme , впервые иммуно-химически были обнаружены ев*э два белка , специфических для СЛ самца D. melanogaster -PEBme11 (hPEBme11 - парная фракция мол. весом в области 40 кДа и IPEBmell - три парные фракций мол. весом в области 10-15 кДа ) и PEBmelll (мол. вес в области 10-15 кДа) , что согласуется с результатами Успенского И. Г. (1990), описавшего белки, присутствующие в разных органов половой системы самца . Из приготовленной кДНК-библиотеки самцов D. melanogaster были отобраны в результате скрининга 42 самец-специфических клона, из которых 2 группы(5 клонов) кодируют продукты, специфические для СЛ Пэказано, что одна группа клонов (No 18, 19 и 39) кодирует белок , иммунохими-чески соответствующий белку PEBmell.Дана характеристика транскрипции in vivo гена белка PEBmell. Определена первичная стуктура кДНК-копии гена белка PEBmell и проведен компютерный сравнительный анализ , который показал с одной стороны наличие большой внутренней гомологии в кодирующей и в "антшеодируиаей" (по отношении PEBmeП-гена) цепи, а с другой стороны - гомологии между кодирующей цепью гена PEBmell и гена Drosophila. FMRFaMHfl-родственного белка (экзон 2) и между "антикодирулцей" цепью и 3'-областью транспозабильного элемента F14, принадлежащего к семейству F транспозабильных элементов дрозофила

-i-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Почти все использованные ь работе методы - авторские модификации , имеющие часто значительные преимущества перед стандартными процедурами , что позволяет их использование в учебно-методической и научно-исследовательский деятельности. Отработана модифицированная процедура нерадиоактивного мечения с использовании uigoxlgenin-ll-dlJTT и гибридизация на нитроцеллшеае и in situ гибридизация на гистологических срезах и тотальных органах, которая может бить нонользавана во всех лабораториях, так как имеет ряд преимуществ: чувствительность как радиоактивного мечения (детекщія до 0,1 пг. ДШ-мішени), отсутствие радиоактивности , низкая концентрация зонда в гидриди-зационной смеси (30-100пг./мл.) и бистрота выполнения. Впервые в мировой практике решена проблема приклеивания препаратов для микроскопии на предметных стеклах - аві орекал методика обеспечивает самое быстрое наклеивание (5-10 секунд), выполннение при комнатной температуре и свыле 95Х надежности ьеотклеивания при последующих обработках. Эта методшса mo.wst быть использована при всех микроскопских, гистохимических и гнбридизационннх экспериментах в разных лабораториях.

Приготовленная кДНК- библиотека и отскринщюваїше самец-спе-цнфические клоны могут быть использованы при поисках епецифи-ческх генов самцов D. melancgastcr . Полученные кДНК-тлпш гена белка PEBmell дактг возможность выделения геномного гена и исследование его структура и регуляции . а также выделения поли-А-РНК для изучения транскрипции и трансляции гена.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Научные результаты работы докладывались на: 6-ом Всесоюзном совещании по проблемам биологин и генетики дрозофилы (Одесса, 1989), 7-ом Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (МоскЕа. 1990). 1-ой Все-сошзной конференции по генетике насекомых (Москва, 1901).

ПУКЛИКАЦИИ. Материалы днссергапии ілралйіш в 9 печатных ра ботах .

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертация состоит из введения описания материалов и методов исследования , результатов и их оС суждения, б'іволов и список.опубликованных работ. Работа изложеі' на я? страницах машинописного текста, включая 11 рисунков .

В процессе клеточной дифференцировки во всех организмах происходит морфологическая и функциональная специализация клеток и это находит отражение в синтезе тканеспециффических белков. Изучэние регуляции синтеза этих белков в ходе развития могло бы дать преставление о механизмах клэточной дифференцировки. Чрезвычайно удобно исследовать эти процессы у дрозофилы . Кроме того , посколько филогенетические отношения видов группы melanogaster детально исследованы , а геном вида D. melanogaster подробно охарактеризован на молекулярном уровне , эти виды представляют собой уникальную модель для сравнительного молекулярно-генети-ческого анализа эволюционных изменений генома в трупе melanogaster.

Внутренние гениталии самца очень удобные среди модельных систем для сочетания генетического и биохимического подходов в анализе механизмов регуляции и дифференциальной активности генов так как морфология и биохимический состав отделов половой системы самца различаются у разных видов Drosophlla (Chen et al.,1985). Можно предполагать, что определенные биохимические процессы, связанные с размножением, являются видо-специфическими Ген-белковые системы , функционирующие в репродуктивных органах , могут, таким образом, служить обіектом для изучения факто ров стабильности онтогенеза в пределах вида и изменчивости онтогенетических программ в процессе эволюционной дивергенции.

Хорошо изученной системой , подходящей для такого рода исследований, является СЛ самца дрозофилы . Этот секреторный орган

- 5 -поставляет ряд белковых .Компонентов сперми , в числе которых у Drosophila обнаружены органоспецифнческие прс/іеидьі: зстсраза S (Koroclikin. 1974) и превалирующий полинептид секрета СЛ - белок РЕВ (protein of ejaculatory bulb) (Людвиг и еоавт. , 1G64), для которых было показано , что они входят в состав гетерогенних белково лшиїдних комплексов , образующий секрет СЛ ( Людвиг и соавт. , 1S85), а Йшколоповиы и соавторами (Yerukolopov el al. ,1983) , бил выделен ДНК-фрагмент, кодирувдій белок , гомологичный эстеравам - локализаїція гена на хромосомах Ц yiiilis показала, что он расположен в области 2G5 , где ранее был картирован ген астерааы-S (Кпрочкнн,Ш82). ыалорныи оріаноспеинфическлй белок СЛ РЕБпк описан также у Drosophila nelaiiogaster (Успенский И соапт. ,1ЯР8) . Дальнейшее изучение генита.гий I), melano^nstti- с точки зрения проблеми виявлений механизмов , учасгвушлх в іиі«-точной и органной диФІїерешії'ровки, вызывает необходимость н более детальном исследовании специфических ген белковых иИ'.-ь-н 0.4

Аутбредные линии Піозорін la, использованные в наших исследованиях были люоезно гредоставлены В. ]'. Митрофановым, \1 Ь. Сидоровой (Ш.;Р, Москва), М .В. Еьгеньеиим ( ИМБ, Москва), 0. Сер да (Иена чин), U. Ліаоернері,м ( Шлнкобритания), Д. Эснидьм.'сром (Испания) и Национальным цепі ром разведения дрозофилы (Боулинг-Грин, США). П настоящей раооте использованы еледуиньие виды и линии дрозофилы: Виды Dtosophila группы virills аутбредные, дикого типа:. D. lutiuiei, (). іюпьаііа. Drosopltila imlanogaster - линия Oregon RfJ, аутбредная, дикий тин. Линии видов Diosophila группы tnelanoeastei , аутбредные, дикий тип: I), пніїгіьіапа, D. sinulans, D. yal.tiba, 1). leissiei і, 0. electa, f). orena, |). anaiiassa^. Линии видов (iicsopliila группы olaoura, аутбредные, дикий тип: її. t'iuuiloolisciiia, Li azteca Липни вилов Piosouhila подгруппы mtilleii, аутпредные, дикий тни: D. |>eiimt;ijlaiis, 0. m i-ront-n^is, D. nojavensis, II. паї I ei is is, l)i oscphi la hyilei, l)i o^uphi la пчшргаи-; II. fiiiiebi is, it. gnat m11 - аутбредные линии, дикий пні.

- б -

Для разведения была использована стандартная питательная срела, содержащая агар, кукурузную крупу, дрожжи и патоку.

ГистолоїНческие срезы D. melaiioKasher для гибридизации in situ были приготовлены сл^луюишм образом: Фиксировали материал в 100 этаноле при -76С в течение 24 часа Затем проводили последовательно в: 100% спирт (50 кшн.), 100% спирт (30 мин), 100% спирт» хлороформ - К: 1 (30 мин) , 100% спирт (хлороформ - 1:1 (30 мин.), хлороформ (30 мин.) , хлороформніарафнн - 1:1 (30 мин.) , параФин 1 (40 мнк.). парафин 2 (ПО мин.). Для ускорения пропитывания использовали интенсивное качание. Заливали в парафин/12% воск и залитые блоки оставляли в воде 24 часа. Срезы приготовляли толщиной По 20 мкм на ротационном микротоме при 25С и наклеивали на стекла обработанные bind-si lane (Si lane Л 174; l.KB: 1850-251 ; Sweden) и белок-глицерином - ллл расплавления срезы наносили на каплю волы и стекла со срезами помешали на 56 О, после чего высушивали ночью в термостате на 37С или 2 часа пол мощным вентилятором . Для удалении парафина стекла помешали на 15 мин в термостат на 56С (расплавление) и сразу преноеили в: ксилол 1 (б мин.) , ксилол 2 (5 мин.), ксилолюпирт 1:1 (3 мин.), спирт 100% 1 (б мин), спирт 100% 2 (5 мин.). После высыхания спирта срезы быстро покрывали слоем bind si lane и подсушивали.

Препараты из тотальных органов были приготовлены, следующим образом: Органы выделяли в PES и переносили на стекло, обработанное bind stlane, высушивали вентилятором, покривали снова bind si lane и высушивали, (гнкенровали в 100% этаноле при -70С за 2-12 ч. FasMopawinann и высушивали . Препараты готовы для иредгибридизации , хранили при 4С в гилр'"Тюбной бумаге или в сухой камере.

мїІКРОБИОЛОГИ'К'ЖИЕ МЕТОДЫ.

Компетентне клетки Е. coli |М 103 были приготовлены по следующей процедуре: Инокулирорали отдельной колонией 5 мл. среды LB. Выращивали на качалке при 37 с в т»ч»нии ночи. Отбирали

- 7 -0,5мл ночной культуры и переносили в 100мл среди SOB, содержащей ЮмМ Mg-Cl. Микробную культуру инкубировали на качалке при интенсивной аэрации до ОДаоо = 0,2-0,3. Охлаждали бактериальную культуру на льду. Осаждали клетки центрифугированием на центрифуге К-23 при 4000 об/ мин., 0С, в течение 10-15 мин. Добавляли 50 мл. охлажденного стерильного раствора, содержащего 50 Ш СаС1. и 10 мМ трис-HCl рН 7,5. СусиендироЕалн клетки и выдерживали во льду 10-15 мин . Центрифугировали 15 мин на центрифуге К^:23 при 4000 об/мин, 0С . Удаляли супернатант и суспендировали клетки в 6 мл. того же раствора.

Компетентные клетки Е. coli К12 У 1090 lisd R были приготовлены по следующей методике: В 50 мл. LB--среды с ампнцилином ( 50 мкг. /мл.) и 0,4% мальтозой вносили 1 мл. клеток из ночьной бактериальной культуре и инкубировали при 37 С до Пооо »0,5 (2,5.10. клеток/мл.) . Центрифугировали Ю мин. при 4000 об./мин. и ресуспендировалн в 15 мл. охлажденном во льду ЮмМ МогЗОч (до Deoo = 2). Сохраняли при 4 С до 3 недель.

Трансформация клеток Е. сої і плагмидной (и RF М 13-) ДНК была проведена в стерильных стеклянных или пластиковых пробирках , при этом тщательно следили ъа. соблюдением температурных условий. 200 мкл. клеточной сусиенсии из несколько колоний в 6yijiepe ТСВ (БОмЫ СаС1; 50іііМ її is-ИСІ pll«7,6) инкубировали 10 мин. при 0С и затем добавляли 10-200 нг. ДНК в обеме меньше 20 мкл . Выдергивали смесь на льду в течении 10 мин . Быстро переносили пробирки в воденой термостат при 420, Еыдершвали там 1,5 мин. и помещали на 2 мин. в лед. Добавляли 1 мл. среды І.В и выдерживали в течение 1 часа при 37 С без качания. Бнеевали на чашки с 1В ага ром с антибиотиком и инкубировали при 37С .

Упаковка молекул лямбда ДНК была выполнена набором для упаковок "Унинак 1" < 1ПТКО "Диагностикум" Москва) по протоколу.

Злектрофире-1 ичеекнй аіічлиг белке и ь дыытурнрушцил условиях бил пронеиен по методу Лиммяи (ІнепипІ! 1U70) с модификсиными . Еуфер Для paaueiwHHn и наиео.-ния образцов содержал 5% JH'il и 5 меркчіїточіаііпин, псма/іьни^ условия, были выполнены согласно ери

- 8 -гнна'іьнои методике: Электрофорез проводили в геле, где соотношение сополшеров акриламида и метиленбисакрилзмида составляло 30:0,8 . В разных случаях использовали концентрацию акриламида в геле от 7,5¹. до 122 . Толщина геля составляла обычно 0,8 мм, длина концентрирующего геля - 2 см, разделяющего - 15 см . Концентрация буфера в разделяющем геле была увеличена в 2 раза по сравнению с оригинальной методикой и составляла 0,75 М трие-НС1 рН 0,9. Иногда для улучшения разделения в разделяющий гель добавляли мочевину в концентрации 7,5 - 8 И В этом случае концентрация ЛСН в геле и в электродном буфере составляла 0,2. Неспе-ииФическую окраску на белок Coomassie R-250 проводили по fVost.erberg 1971). Для определения молекулярных масс Селков их подвижность сравнивали с подвижностью маркерных белков. Для приготовления образцов индивидуальные органы имаго Drosophila и це-лнх особей гомогенизировали в буфере для нанесения образцов, а затем помешали пробы на 5 мин на кипящую водяную баню. В ряде случаев для улучшения результатов разделения применяли предварительное обезжиривание органов з смеси хлороформ: метанол (2:1). Перед нанесением образцы цек рифугировали 10 мин. 10 000 об. /мин. Для приготовление образцов для электрофореза белков СЛ D. melanogaster органи препарировали под бинокулярным микроскопом. На одном блоте наносили материал 2-5 СЛ В ходе работы было установлено, что результаты разделения сильно зависели от условий приготовления препаратов и/или использования разных экстрагирующих растворов . Использовали следующие условия: 1. гомогенизация в буфере нанесения (D - 0.0625М трис-HCl рН 6,7; 10% глицерин ; 0,01 бромфеноловый синий), 2. гомогенизация в буфере D с 0,5 Тритона Х-100, 5. гомогенизация в буфере D с \7. дезок-сихолата натрия . Препараты перед нанесением центрифугировали 10 мин при 100О0об/мин.

Гибридные белки рекомбинантных клонов били выделены методом Carol 1, Logon, 1089 и Rio et al. ,1986 с модификациями: В 2 мл среды LB с ампициллином в концентрации 50 мігг/мл инокулировали материал из одной лизогеной колонии и перемешивали интенсивным встряхиванием. Бчктериальую культуру инкубировали при 37С с интенсивной а^рчцией и. к'ігда Dnno становилась равным 0,4-0,6, отбирали 1 мл в другую пробирку . к зтой части культуры добавляли

- у -ШГГ до концентрации 1 Mil . Обе проби инкубировали еще 2 часа . Клетки из обоих частей культури (индуцированной и контрольной) осаадали центрифугированием на центрифуге Eppendoiг в Течение & мин. Супернатант сливали,а клетки суспендировали в 100 мкл. дистиллированной воды . К суспензии бистро добавляли 200 шел буфера образца для электрофореза белков (5 ЯДСЛ; 5% бета-меркаптоэта-нол; 0.062М трис-11С1 рН 6,8; 10% глицерин; 0,1% бромфеноловий синий) и инкубировали 2 5 мин. на кип л щей F-одноп бане . Анализ белков проводили методом электрофореза в 7,5 ПААГ с ДОН (La-iiunli 1970) .

Во ьсех случаях иммунизация била проведена по схеме Дорфма-на (1967) - ибични использовали антиоиьорстки 3-го - 4-го циклов иммунизации. Антисьворотка к суммарным антигенам ОЛ D. ruelaoog.v,-ter была ль/іезно предоставлена М. 3. Людвигом.

Получение аффишю-очищенних поликлональних ашигел пило проведено но стандартной методике (Gireid eL al. , 1085j о небольшими модификациями. После алектрофореїичеекого разделения белков Е. colivltjLlI рекомб. в ДМІИІЛАГ и з.кктгопереноеа на нит-роцеллкиьау их скрлшивлли О, IX раотгором Попсо-0 в IX, уксусной кислоте . После отмывки водой вырезали окрлкх-нную полосу , соог-ветствуицую гибридному белку. Вырезанные 2-4 гюйиски.нзмельчен-нпе на куски размером Зх'^мм. ішкуоировали с иммунной еывиротк^й антпч.Л f 1:200) в течение 1,Ь ч. ;огмивку or неевязаьшнхея антител вели так Ае, как пр.п иммунном икрашиьании б пота . Специфически связгичічіО'.'іі aiiiiiitrjia адтлли оучУ-рои 5 пі' г.чинин-НГЛ ph 2,b . При Необходимости после нейтрализации раствора аІІТШеЛа осаздлли полунаеиш-'нним раствором сульфита аммония с добавлением

0,2Ь/1 OU41 ей eUBOpuTKH . Обессиливание р.іСТВорл аНТИ'1'ЄЛ НОСЛе

осаждения ЦенгриІуі'Ированіїем и растворения в PBS проводили на колонке с t.V-фадекс (j 25 .

Имі'унизлек-і'роплоітіінг белков бил осуществлен , как описано

1'оуОИіНЛІ И Гі'рЛоНоИ l I'OWtuii, (ill don i'jtij). ЯікГТрОПереІІО.4 белков ІІЗ ІІоЛИаКріІЛаМИДПоІ о і eJbi ll.t НІ11ро|І> ЛЛЬ'х'К. іІГуІп м-йбрану ИроЬОДИНИ

в грис і лиііин-і >.м пу:|>.-|-:, еоііер#лш<-м :й% отанолл и о,(.Ьі Д;'іі

ii'Li Іір<Л(о|І:|..іі1і ІНІ.І Неі.|і'.1іН|і|'с- '1.1 І о СВ,і. Ічі'-іНІЬІ аНТИіеЛ ОЛіїТ ШІ
КуОПр л і 111 1 Ч h Mil rut-. |.1г.'і |;р_;!Іі:.,| і, р.Л іГоїл СІ".' ї\і Ні і'р.
ІІрИ !lf і' І!(!М)-|нН. . і.'і' .|.оі|-Ц р іі-і:. Jill НИ h !^;и0 |<" І р-і;- [ Г ], :,

- 10 -держащим 10% сыворотки крупного рогатого скота и 0,05% Твин-20, инкубацию проводили в течение 4 часов при 20^РС. Отмывку блота от несвязавшихся антител осутествляли последовательно растворами РВЗ-Т: 0.6 М NaCl ' 0,02 М трис-HCl pH-S,9;FBS-T. Отмывку каждым раствором повторяли 3 раза по 5-10 мин. на качалке. Дли выявления связывания кроличьих антител использовали аффинно очитенные козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, коньюгированиые с пе-роксндазои хрена (Ш1К "ЕноС"), разведенные в 1000 раз; время инкубации - 2 часа при ?.0С . Дня визуализации п»роксипазнои активности использовали реакцию с 1-хлорончфтплон или 3,я дпамнно-бензпдином в качстве субстратов (llawke? et al. 19R?).

ПІК из Drosoplula melanopaster получали по следующему метолу: Мух гомогенизировали в жидком азоте пестиком в ступке. Переносили в ручном гомогенизаторе о 15мл. 4М гуанидинизотиоцнана-том. гомогенизировали на ледяное бане/15 тракпии/. добавляли 15мл. кислого забуфорироьанної > Фонола {&.F(!) / 5 тракний / и 15мл. буфера (0.1 М СНзНООМа рН-4.0 ; ЮмМ Tr fivlii.'l pll-7,4; 1мМ ЕПГА) /5 тракпии/ , или переносили и гомогенизировали в 15:15 мл. холодном , насыщенном водой, кислом Феноле/лиэируип^м буфере (О.ЗМ ацетат ншрия рН- 5.5; Юіг.М ГОТА; 0.8"? SPS; 0.1% РІТГЛ. Добавляли 15мл. ненасыщенного хлороформа , сюро-чмо , но хорошо прмеіі!ивали и центрифугировали ГО минут при П СЮО об. /мин. Родную Фазу экстрагировали однократно фенол'хлороформом и "-кратно хлороформом ; затем к н"(1 добавляли равннА обем I-пропанол/ 1,5мл./ . Оставляли на іючь при - ГО"С. Осачлали центрифугированием ГО мин. при 5 СЯО об./мин. Осадок растворяли в 1 мл лист. волн. 2 раза п^орпс.*ажлали О. г->м <~Тм':<""'Na рН-Г>,0 /і иропчнол, 1 раз - О.Г'М ацетата натрия/ \оо?. -татла и \'омывали 70% этанолом . Осадок ПІК рт^,тр"і'^ппіі в диет. p'W. изхолл из нр^лвариг^л-ных данных что из 1с мух получали при^пиаит^лып 1"« IНК , и хранили при -Г0(-7О)С .

ПІК С.Л была тлуч^на m ел^-дуип' П пр'чглуре; it r-rvn ''Л добавляли Г.Тім.ч. лидирую"? [ '> буфера ( ЛГ)|..м Ті г l!''l j-H-7.4: ІОп+1 FPTA; П.ГЛ ~.Р';; (1. IT іч'Ч'-т-е у- щ-.нш-.-'-иг'Ч'-цчпю :'ч іч н ,Ч~ ''

для самопереваривания) и инкубировали 45 минут при 25 С и Юмин. при 37С. Экстрагировали кислим фенол./хлороформом и интенсивно перемешивали. Осалд&ди 0,3 ы ацетата гіатрия/2, Г сбьема этанола в присуствчн БОмкг. тРНК-носителя. Переосаадали 2-кратно, промивали "07. этанолом и растворяли в диет, воде, обработанной DEPC-gm.

Поли-А обогащенная РНК была получена, пропусканием выделенной ДНК через колонку с олиго-дТ-целлюлезой 2-кратно и затем пе-реосааданием 2-кратно 0,ЗМ ацетатам натрия/ этанолом (2 обьема)

Электрофорез РНК проводили в 1,2% агарозе в 2,2 М формаль-дегнде/25мМ фосфате натрия рН-7,0 - 16 часов при 0,8V/em в 25мМ фосфатном буфере рН»7,0. Пробы растворяли в: 2СнМ фосфате натрия; І50Х формамид; 2,2мМ формальдегид ; 0,41 оромфенолоЕО синий и прогревали 15 минут при 5БС. Окрашивали после переноса на нитроцелюллезу (без щелочьной денатурации) в 0,04% метиленовим синем в 0,5М ацетате натрия. Качество поли-А+ - FHK "цениьали, проверяя на злеістрофорезе качество поли-А- - РІЖ после колонки .

МЕТОДЫ ДЛЯ РА )ТЫ С ДНК

ДНК бактериофага лямбда gtll била получена но методу: В 1л. 2хУТ-средой с антибиотиком добавляли 50 мкл. из ночника Е. coli К12 Y1090 lisdR и одне фаговую бляшку диаметром 1 мм . Инкубировали одну ночь (14 ч.) при 37С. Определяли титр фага . Центрифугировали 15 минут при 3 000 об. 'мин. К суиернатанту добавляли РНК-азу и ДНК-азу до 1 мкг. /мл. Инкубировали 1 час при 25оС (или 1 ночь при О С) . Добавляли ПЭГ 6 000 до 107. и llaCl до 111 Держали 1 час <до 1 ночь) при 0^йС. Центрифугировали 20 минут при 3 000 об. /мин. Хорошо удаляли остаток жидкости . Осадок растворяли в 5-10 мл. ТЕбуфер + 20піМ Ьі'ЗОч (MgCl). Экстрагировали равным объемом хлороформа*' і -амиловый спирт-24:1 до полного от-суствия осадка в интерфааи (около 2 раз) . Добавляли ЭДТА до 20niM и экстрагировали равным объемом фенол/хлороформ до полного, отсуствия осадка , а затем еще 2 раза хлороформом. ДНК оеаздалн добавлением ацетата натрия до 0,Н! и равного обіема і-нроііаііола. Для анализа рекомбинантных клонов лямбпа gtll, рекомоин. ДНК била получена по протоколу "Лніеі гііліт" о модификациями: К 4 20 мл. фагового лизата побнвляли рагль'и оСем "ОХ ГШ tQOO\ Ш \Ш'.\ в SM буфере и инкубир'Шнли І чаї.- при 0«\ омрачи (Г'О

- 12 -мин. при 4000об/ мин. /, растворяли в 750 мкл. SM, добавляли 750 мкл. DEAE 52 целкшюэы в 5М и инвертировали 30 мин. Центрифуги-ровали, к 1 мл. супериатанта добавляли протеиназу К и SDS соответственно до 2,5 мкг. /мл. и 0.42Х, перемешивали 5 мин. и добавляли 173МКД. ЗМ ацетата калия. Прогревали 20 мин. при 88С, охлаждали при 0С 10 минут, центрифугировали и ДНК из супериатанта осаждали этанолом .

ДНК бактериофага М 13 была пол/чена по методу Лезина (нео-публ. ,1991) : В 10-100ml богатой среде добавляли ночная культура Е. coll К12 JM103, разводя ее 100 раз, и 1 фаговая плака М 13, диаметром lim Выращивали 6 часов при 37С. В 100ml богатой среды добавляли 1ml от этой суспензии и 1ml ночной культуры Е. col і К12 JM103. Выращивали 8 часов. Центрифугировали стерильно 15 минут при 4 000 об./мин. , супернатант переносили в новую (или в первоначальную) стерильную колбу, петлей вносили клетки из полученного осадка и выращивали до стационарной фази. Центрифугировали 15 минут при 4 000 об. /мин. Можно повторить еще раз этап наращивания биомассы (количества фаговой ДНК). Осажденные клетки лизировали для получения RF ДНК по методам получения плазмидной ДНК, а к супернатанту добавляли PEG 6 000 и NaCl для получения одноцепочечной ДНК пс стандартным процедурам - осаждали фаговых частиц 0,25 объема 3.5М ацетата аммония/20% PEG 6000 (30 мин. ;0^Г'С), осадок растворяли в ТЕ , экстрагировали 1 раз фенолом и 2 раза хлороформом, осаждали этанолом и растворяли в ТЕ. По этой процедуре получали очень большой выход Фаговой ДНК из очень маленького обема средой.

Ориентация вставок рекомбиантных фагов М 13 пр8 была определена по методу Гарднера (Gardner et al. ,1981): В пробы с 20 мкл. дистиллир. воды вносили попарно по 0,5 мкг. одноцегочечной ре-комбинантной ДНК во всех возможных комбинациях (в контрольной пробирке - только ДНК одного рекомбинанта) . Вносили по " игл. 2% SDS, инкубировали 5 минут при 65С, добавляли по 2 мкл. 0.5М МаС1 и инкубировали еще 1 час при С5С . После добавления по 5 мкл. гельсодержащий буфер, сепарировали на электрофорез» е 0,7% агарозе - комплементарные цепи образуют более меллннне 8-подоб-чых структур.

Реакции расщепления ДНК реотршггаяами Pstl. Bamlil и Hurt III

- із -

били провеадеои ь буфера KIND (ІШИ трпо-НОІ pH"7..5/50nM NaCl/ІОмМ (AjCl. /5Ш [З-мері- ттоэтанол/ЕмМ епермидтп . На 1 мкг ДНК добавляли S-Ійед р.;стрикта.ш. реакции рестрикции ДНК ь^ли

ПРИ Ь'ҐО В ТбЧеИИе J і.' ЧАСОВ . ІІШЮТУ реСТрИКІШіі КОМТрОЛИрОЬ&ЛИ

здектрофоретйческії . Донориие Фрагменти и вектори перед ЛИП'.ро-ванпем очинили электрофорезом t агарове (Сі,5 - 1,Ь%, буф.-р ТАЕ) в присуетв.чи бромистого атидня. 13 качсстье м;-ркерц дли» <|f " '^te'i-тов ДІЖ испольвовали продукти расщеп ненин ДШї фаіа . ргогрикга-аами llmdill и EooRI, а так**.' ДНК p№".P2, раешни-нную рестр:ік-тааои Kkcl . Зону , ссдержамум нулнь.й ^аі і.:ент ДІМ, определили в ультрафиолете є длиной воліш :/04 и. м. и mjpti.'-uiii ь миііг.милі ном сбгемо агароьи. фрагменты ДНІі получ їли aJu к;|.юіімфоьанпен в дії

ШіИЗНОМ МОШКе ИЛИ Ь "бу'і'ербрОДИК.;" : "ViVit in il:li оШ"/ДИ дЛИсІІгіЛ

мембрана с последующей 3-кратной элвдшг-н буфером ГЕ в микропент-рифуге. Д1ІК очищали циалиаой 1Г:-24 часов iip-..тіж IF. .

Линеаянзованная векторная Д11К бича дефос^орилиропана ь буфера СІР (0,5М Tns-HCl рН~9,0; ICji'.W l.^'Cl ; \Ш 7l,Cl ; ЮпМ спермидіш) палочной фоефатазой (0,015 If/1 pnol ДНК кошіоь) после инкуцбации 1- 2 часа при 370, и после прогревании 10 к'и.ч. при 68С , 1 рой экстракции фенол/ хлороформом и 2 раза хлиро.)ормом и осаждения этанолом, растворена в ICiiM Trls-iW-1 pll-8,0 .

При составлении смеси для лшироьани.ч , в пробирку ь uOLo.ie 5 мкл. било внесено: 50-400 иг. раствора Дс.ил.-ф.рнпнрог.анной векторной Д1Ш, 4-кратішй молярний иі-Пітск донорноги Фпагчента , 10-ти кратний Oyijep для лнгирования (O.f!:.),( трис-НГМ pit 7,-1' 50иМ MjCl./ 50mM днтиотрейтол/ЮмМ AT'10 і' 10И ДНИ .иш ази >іаі:і Т-1/1 ккг. векторной ДІЙ . Затем проб» лерыюонлн на водную баню (12-15С), инкубировали 12 24 чао* а реакцию иетанапливаїїи добавлением EDTA pll-8,0 до Шпі/А ilet-ед трансфери tint-й проби іш><у-бировали ІОмин при 65оС длл инакп'юпин лигами, а «нтем олбіем доьоднли денонивованной водой до 'и0 мкл.

Зонд для lfo;?-ep- и Оауэерн гнбрндивашш бил нриюі"ivieM доо-траиваннем концов реотршчц*данной вставки Фрагментом "ІО^нола" ДИК-пол. 1 п присутствии р м-ченного <*NH-> я бур-v* Ш"0 с добавлением ь МІ ф'р⁽*чіг -⁷1 мкг. ДНК ivi'nj-1'п

Зо«Ч И.-ІЯ HepH,UHO.lKTUt'Hort ПЮрнЛИ:-.-ІІІИИ ГКЧ |i| |i| ..(, hlit-ii ВКЛ1"<>>'-

нием в Ц.-ЦИ ДНИ tJiKOHitfeiiin-ll іШ'П- т їм*- ?. >i НИ'.- , j.hj.uj.'M ли.;-

траиваннл второй попи рекомбинантного tora М 13 mp 3 с "прямим" примером при помпе» фрагмента "Юкнова" ДШ'лои. -І . Затем вставку вунієпляли при помити реотрпктаги EccR ! или рестриктаза-ми Smal и Ехе і /уннает саіїї рестрикции Narl /.

фрагменты ДНК были выделены сепарированием в 0,6-1,5% агарове, перенесены !!'. "бутербродике": "Whatman" ЗММ/диали&ная мембрана и алюнрованы 3 раза 50 мкл. ТЕ-буфером в 1 мл-вую пробирку "Eppendci f" через 200 мкл оьой наконечник - центрифугированием 10 секунд при 3 5 000 об. /мин.; хранили при -20 С.

тт\<хттт:\

Кммуноскрніїинг лямбда ct It рекомбинантных клонов был выполнен по следующему метолу: К 150-200 мил. компетентных клеток (Dcoo-S) добавляли по 100 мкл. фаговых частиц (при первичном скрининге - по около 20 000 ; при вторичном и т.д. - по 1-2000; при последнем - по 50- 200 ф. ч.), инкубировали 15 мин. при 42 С, добавляли Змл. верхнего (0,7?-) агара в L.B-среде с температурой 47-ПО С и быстро залипали на ннжлом (l,ZX) иихном агаре в L.B. Инкубировали Яч. при <12С. Сразу после появлении бляшек бистро накладывали сухие ішт|ю!рлішіезиі'е фильтры , заранее пропитанные Юм.Ч IPTG и пронум"рованы, без образования пузырей. Продолжали инкубацию еще 3 часа при 37С . Отмечали положение фильтра на чашке тремя асимметрическими проколыми . мльтры промывали 30 мин. в буфере ТРГІ (50nW Trtr--MCl pl!-8,0; 150шМ NaCl) на качалке и инкубировали ? ч. п 20~ телячьей сыворотке в PES, а затем -еще 30 мин. о Л'^анл^нием О.СЪХ TVecn-20 (TBS-T). Инкубировали 4 часа в анти-С.Пі<*^>-кроличь^ой антиеыворотке Г разведение 1:200) и Е. coll - лямбда pt 11 - белковом акотракте в РВЗ-Т С 20Х телячьей сывороткой . Лалыш об[)абатывали как при иммуноэллектробло-тнпге (см. в!⁰).

Определяли местоположение позитивных бляшек на чашке "Петри", вырезали сол^ркашие их куоочи агара (Sxi'wi) и помешали в 1 мл. буфера 5М. Хранили при 4С.

ЛмплнФшшровчнную библиотеку экстрагировали из агара отмыванием" оМ 12 ч. при 4С и хранили с лабамрни-м 1/ПО ofv-ма хлороформ при 40.

- 15 -МЕТОДЫ ГИБРИДИЗАЦИИ.

ДШ (ДОЇ-; Блот-) гибридизация била проведена в формаыид-ном буфере . ДНК-мишень для ДОТ-гибридизации была обрабатаиа и нанесена на ВА-85-нитроцедкшюзу (d*0,2-0,45 мкм) по следующей процедуре: В 20 мкл диет, воды вносили по 1 мкг. ДИК каждого ре-комбинанта и прогревали 10 минут при 100 С для разделения цепей. Сразу охлаждали в ледяной бане, осаждали капли центрифугированием 5-Ю секунд на микроцентрифуге v. заново ставили в деденой бане. Добавляли 1/3 часть объема IN НаОИ и инкубировали 20 минут при 20оС . Нейтрализовали 211-ш МНчООССНз pll-7,0 добавляя его до 1М (3 обема). (Иногда использовали: 1М HaCl; 0,3M Na-cytrat; 0,5Н TrisllCl; ЇМ ПСІ). До нанесения хранили в ледяной бане. Проби ДИК наносили на нитроцеллюлозу в обеме для нанесения 100 мкд. (разводили водой или ТЕ-буфером ) на ДОТ-аппарате - под нитроцеллюлозой закладывали "Whatmann" ЗММ, промокнутый водой. Нитро-целюллозу сушили 1 час на воздухе или 10 минут под лампой. Про-мизали 5 минут в 6 х SSC при 2СРс и высушивали на воздухе. Фиксировали в вакуумной печи 2 часа при 80 Сі или ночь при комнатной температуре) и 0,6-0,9 bar. - нитроцелюллозний фчільтр закладива-'ли между 2 фильтр, бумажками. Предгибридизацню проводили 4 часа при 42С (или ночь) в полиэтиленовым пакете в буфере для пред-гибридизации (0,2ml буфер на 1 квадратний сантиметр нитроцелш-лозе). Состав буфера для предгибриднзацин: 507. формамид (деио-низ. ),бх Деихард: (0,1% фикол-400, О,IX BSA, поливинилпиролидон. бх SSC, БОпіМ На-фосфат рН-6,5, 250 мкл/мл. сонифицнрована ДНК сперми лосося или крупного рогатого скота, 0,1% SDS, 10 мкг./мл. поли-А, 10 мкг. /мл. полн-С. Гибридизацию проводили 48 часов при 42 С в запаянном полиэтиленовым пакете. (50 мел. гибр. буфер на 1 квадр. сантиметр нитроцелюллози). Состав буфера для гибридизации: 50% формамид, 1х Денхард, 5х 3SC (можно 0.5х S3C), 50тМ На-фосфат рН-6,5 , 0,5 ng/ml соннфицированная ДИК сперми лосося (кр. рог. скота), 0,1% SDS . 10 мкг./мл. поли-А (U.T) , 10 мкг. /мл. полн-С, ДНК меченного зонда , прогретая 5 минут при ІООоС и охлажденная сразу при 0С. Для гибридизации использовали Р-іШТР-аонд с уделышой активностью 5.10 - 1.10 на 1 мкг. меченной ДНК или 26 нг./мл. dig-dUTP-меченной ДНК размером FOO-1O00 н. п. в 2,5 мл. буфере для гибридизации на 100 квадр. см. филь-

тра Максимальная чувствительность метода имеет место при проявлении цветной реакции больше 2 «асов и концентрации dig-DHA-зон-да 50 иг. /мл . В гибриднзационный буфер добавляли 3% BSA (обеэ-яирешюе молоко , или 5% блокирующий реагент). Высушенный нитро-целюллозный фильтр запаивали п полиэтиленовый пакет . Отрезали уголок , вносили зонд , буфер , выгоняли воздух и запаивали. Инкубировали во влажной камере при 42С. После гибридизации несгиб-ридизовавшийся зонд отмывали но следующей процедуре: 3 раза по 20 минут при 20 С в 2х SSC; 0,17. SDS В объеме 200-500ml;-1 раз 30 минут при 65С в O.lx SSC ; 0,1% SDS в объеме 400-500ml - при использовании высоко гомоло.таые гибридизационнные пробы или 1 раз 30 минут при 20С - при использовании кДНК- зонд. Высушивали на воздухе. Рентгеновские плетей экспонировали 20-40 часов при -70 С. Для повторного использования специффический зонд снимали с нитроцеллолезного фильтра кипячением 5 минут в 500 мл. О,1х SSC; 0,1% SDS. Высушивали 5 минут под лампой, промывали 5 минут в 6xSSC. Высушивали под лампой и дальше обрабатывали по протоколу.

В случае'мечения dig-dUTP и bio-d'JTP детектирования гибри дов меченная ДНК проводили следующим образом : Фильтры промывали 3 раза по 15 минут при 20С В 2х SSC; 0,1% SDS и 2 раза по 15 минут при 65С в O.lx S5C; 0,1% SDS. Затем либо использовали сразу, либо высушивали на воздухе для болего поздное детектирован!!. Дальше все процедуры выполняли при комнатной температуре. Фильтры замочивали на 1 минуту в буфер-1: lOOmM Trls-HCl; 150mM HaCl; 0,05%Tween-20 pll-7.5(20oC) . Инкубировали 20 минут в 100 мл. буфер-2: 3% (w/v) BSA в буфер-1 . Высушивали 10 минут при 80С, замачивали еще 10 минут в буфере-2 и снова высушивали. Міново замачивали в буфдре-1 на 5 минут. Инкубировали 30 минут в 20 мл. разбавленного раствора антитело-коньюгата /1:5000/ . Отмывали несвязанного специфически антитело-коньюгата 2х по 15 минут в 100мл. буфер-1 и 2х по 5 минут в буфер-1 без Твина Уравновешивали мембрану 2 минут в 20 мл. буфера-3: lOOmM Trls-HCl; lOOmM HaCl; DOmM MgCl ; pH-9,5(20oC). Инкубировали фильтры в темноте в 10 мл. свежеприготовленного раствора для окрашивания в запечатанной пластиковой пробирке : 45 ьлл. раствор НВТ ; 35 мюі. раствор Х-фосфата в 10 мл. буфер-3. Цветной преципитат на-

- V? -чшшет образовьшатся через, несколько минут, но реакция закшічиьа-ется через 1 день. После появлении ЛоЛосї или пятен реакции останавливали погружая мембрану на 5 минут в 50 мл. буфер-4 /ТЕбуф-фер/ : ЮМ Tris-HCl; УМ EDTA; рИ-3,0( 2СЧ>С) . Сильтри можно ш-сушить при комнатной температуре и ни при 80 С и сохранить . При высушивании окраска ослабляется . Ш высушчиали, если било необходимо использовать их заново. Цвет можно воеетаноЕить замо шьая мембрану в буфере-4.

ДІ1К-РІІК гп situ гибридизации на гисїолог. срезах и тотальных органов бша выполнена по протоколу Oephalon її,с. .Vest Cester, PA. USA с нашими модификациями: Предгі:бридизациіо ириподи-ли 1 час при 42-45С в 6У'рер.э для предгибриднзации, содержащий 0,25 ng/ml tRNA (можно еде Ил-лаурилсаркп.мнн, длл предотвращу ния неспецифического связывания). Накривали силиконированним покровным стеклом или полиегилыювоп млеікон. Денатурнросали аонда кипячением (2 минути). Сраау ехла вдалії во льеду. Хранили при -20С. Гибридизацию проводили в обьеме 20-50 місі. (Л цкл. (3ng) die-меченного зонда в 50 мкл. предгибридизашюнном буфере) при 42-4ЬС ночью (12 Зі) часов) под енлнкони»<овашіим стеклом , запечатанном резиновым цементом, зо влажной камере . Удаляли цемент , снимали осторожно покровные етегла и проминали предметные стекла в обі-еме 20 30мл. соответственно: Зх но 15 минут В 2xSSC при комн. темр. (КТ) / lx Г-С минут в 50Z ііормамнд, 2XSSC при 42С. / 2х по 10 минут Е 2х^СС; 0,17. Ж> при КТ. <' 1х 10 минут В O.lxSSC; О, IX SVS при КТ. /1x5 пину с н 2х СГ при КТ. / 1х б минут в РГС. при КТ. / 1у 5 минут в FB5 ; 0,05% Tween-20 (PBS-TntonX 100) при КТ. / 2х по 5 минут в IBS. Л ля детекции связанного зонда сперва отмывали в обійме 20-30 мл. соответственно: 1х 5 минут В буфере 1 (ІООнМ Ті i-j-HCl рІР-7.6; ШЬМ НаСІ). / їх б минут в буфере 1 < 0,^7. Tween-20 (Triton Х-100) / Іх 5 минут в буфере 1 + 0,3 I«t-en-2j * Іо.і бычья сиьо;чзтка. It» каждом стекло наносили по 50 місл. раженої і анти «1 іу аіпиіч-.'ювого конюгатн (F\ib fragment) в I'll в раанедении 1:5000 (150mu7ml). Накладывали сверху сипикичірчі-анної,* ноі'.|-овно« сті-кло , стараясь избрать и; Rupert . Ичкугир.ам tv» минут іі| и кімнатної! температуре . llpi-лкк'тныч r текла намивали .< рана ію 20 минуї в 50 мл. И'с; Т . rvnvM их промыва їй ' м»нуг в пу>|. р»- ;> (П.їм.

- 18 -Трис-НСІ; 40nW Ц;П1; 0,1 M ІіаПі; р.Ч-Я_;51. В эпнендорф добавляли І.&мкл. раствора МБГ /n:tro blue tetrazol mm/ к 300 мкл. буфе-ра-2, смегаивг.ли переворачиванием, добавляли 1 мкл. раствора Х-фосфаіа (ООП') м перенашивали. Наносили по 0-50 мкл. на отек-10 ?.;:х40мм и следили аа проявлением черев 12-48 часа После того, как окраска птаїивитюя достаточно интенсивной, промывали 2-?Л часа в дистиллированной иоде (хорошо отмывается неспецифич. окрашивание). Реакцию останавливали промывал b минут в ТЕ-буфзре (1С Ш Tri:;-HCl рН-8,0; 10 Ш tDTA) и подсушивали на воздухе или заключали в глицерин .

Определение первичной структуры ДНК было вьгаолноно методом Сэнгера по протоколам и наборами для секвенирования НШ "Биопол" (Фрагментом "Кленова" ДІІКпод. 1) и ИІЕЗ "Фврмєитас" (модифицированной ДІШлол. фага Т7) . ^акционирование продуїсгов терминации бы по выполнено в Ъ-ЬХ денатурирующих !!ААГ в їх ТВЕ .