Введение к работе
Актуальность проблемы,
Клетки, изолированные из эмбрионов млекопитающих, в специальных условиях культивирования на протяжении многих пассажей сохраняют готюрипотентность - способность дифференцироваться во все типы клеток как собственно зародыша, так и экстраэмбриональных тканей. Такие клетки получили название эмбриональных стволовых (ЭС) клеток.
Благодаря плюрипотентности, ЭС клетки, инъецированные в зародыши животного того же вида, могут инкорпорироваться во внутреннюю клеточную массу (ВКМ) зародыша-реципиента. Размножаясь совместно с его клетками, они образуют химерный эмбрион. Важно отметить, что зачастую ЭС клетки колонизируют зачатки зародышевого пути, тогда химерное животное может продуцировать гаметы генотипа ЭС клеток.
Способность ЭС клеток размножаться длительное время в культуре, сохраняя плюрипотентность, делает возможными различные манипуляции с ними, как например, введение в них чужеродных генов или индуцирование направленных мутаций ("gene targeting" и "knock out") (Capecchi, 1989), с последующим отбором нужных вариантов. Это обеспечивает два основных аспекта использования ЭС клеток: 1) в качестве переносчиков чужеродных генов при получении трансгенных животных; 2) в качестве модельного объекта для исследования проблем генетики развития. Например, инкорпорированный в геном ЭС клеток "ген-репортер", по экспрессии которого определяются дериваты этих клеток в химерном зародыше, дает возможность прослеживать межклеточные взаимоотношения в процессе онтогенеза, изучать стадии закладки тех или иных тканей и решать другие подобные задачи.
Впервые возможность культивирования in vitro плюрипотентных эмбриональных клеток показали Evans и Kaufman (1981) и независимо от них Martin (1981), используя в качестве доноров бластоцисты мыши. Успешное развитие работ по получению ЭС клеток мышей и открытие методов направленного внедрения в геном чужеродных генов (gene targeting) и "выключения" дефектных генов (knock out) явилось стимулом для работ по получению ЭС клеток "у других видов лабораторных
животных и у сельскохозяйственных животных: свиней и овец (Notarianni et al. 1990,1991; Kedrahita et al., 1990a,b), крупного рогатого скота (Anderson et al., 1992), кроликов (Giles et al., 1993). Но разнообразие видов животных, у которых делаются попытки получения шшрипотентных ЭС клеток, пока что невелико. Поэтому актуально расширение списка видов животных для получения ЭС клеток.
В Институте цитологаи и генетики СО РАН на протяжении ряда лет ведутся исследования биологии, эмбрнологаи и генетики американской норки. Сотрудниками этого Института д.б.н. ОЛ.Серовым и д.б.н. Н.Б.Рубцовым с соавторами проведена большая работа по картированию хромосом норки. Благодаря их исследованиям этот вид выдвинут в ряд наиболее хорошо генетически изученных, и поэтому является подходящим кандидатом для опытов по получению ЭС клеток.
Как ценный пушной зверь норка разводится во многих хозяйствах нашей страны и за рубежом. Возможно, использование ЭС клеток и метода "gene targeting" открыло бы новые перспективы в селекции норки и в изучении ее эмбрнологаи.
Отсутствие опубликованных работ по получению ЭС клеток не только у представителей сем. Mustelidae в частностино и у отряда Carnivora в целом, довольно хорошая генетическая изученность этого вида, перспектива практического применения ЭС клеток при селекционной работе с норкой явились предпосылками выбора норки для настоящего исследования.
Цели и задачи исследования.
Целью данной работы было получение набора линий ЭС клеток американской норки (Mustek vison) и детальная их характеристика, что в первую очередь касается такого важнейшего их качества, как плюрипотентность.
В работе были поставлены следующие конкретные задачи:
1.Оценка пригодности в качестве фидера для культивирования ЭС клеток норки первичных эмбриональных фибробластов мыши, первичных эмбриональных фибробластов норки, а также двух линий перевиваемых фибробластоподобных клеток норки.
2.Выделение линий ЭС клеток из эмбрионов норки разных стадий развития: морулы, ранней бластоцисты и внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты.
З.Цитогенетическая характеристика полученных линий ЭС клеток с использованием G-дифференциальной окраски хромосом.
4.0ценка плюрипотентности ЭС клеток в условиях их дифференцировки in vitro с использованием анализа активности X-хромосом и иммунофлюоресцентного анализа набора клеточных антигенов.
5.Оценка плюрипотентности ЭС клеток в условиях их дифференцировки .in vivo с помощью гастологического анализа эмбриоидных тел (ЭТ) н тератом.
Научная новизна,
В результате проведенной работы была впервые получена из эмбрионов норки на разных стадиях развития серия линий эмбриональных клеток норки, адаптированных к культивированию in vitro.
Показано, что все линии имеют нормальный кариотип без видимых хромосомных перестроек. Установлено, что в некоторых линиях эмбриональных клеток, имеющих генотип XX, обе Х-хромосомы находятся в активном состоянии в большей части клеток, что подтверждается анализом активности сцепленного с Х-хромосомиой гена гаюкозо-б-фосфатдегадрогеназы. В этих линиях ген ГбФД активен в обеих Х-хромосомах. Показано, что полученные линии ЭС клеток норки при дифференцировке in vitro способны давать производные всех трех зародышевых листков и образовывать простые и сложные эмбриоидные тельца. Две линии, имеющие генотип ХУ и происходящие из морулы и В КМ, при введении атимическим мышам образовывали опухоли типа тератом, что свидетельствует об их высокой плюрипотентности. Эти линии признаны пригодными для дальнейших экспериментов по переносу в них генов и для получения химер.
Таким образом, полученные данные содержат новую информацию о высокоплюрипотентных линиях ЭС клеток еще одного вида млекопитающих, представителя отряда хищников. Эти линии могут быть использованы в исследованиях эмбриологического и онтогенетического плана, а в перспективе - для получения трансгенных норок.
Основные результаты получены и описаны автором самостоятельно. Часть результатов и материалов получены совместно с Голубицей А.Н., Железовой А.И., Ватолиным СЮ. и другими соавторами, которым, пользуясь случаем, автор приносит гпубокую и искреннюю благодарность.
Апробация результатов.
Материалы диссертации были доложены на I Европейской конференции по достижениям в эмбриональной технологии и генетической инженерии, Краков, 1994 и представлены стендом на 42-ом Национальном генетическом конгрессе, г.Кашамбу, Бразилия, 1996.
Объем и структура работы,
Работа изложена на 74 страницах и состоит из введения, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 83 названий. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 7 таблицами.