Введение к работе
Актуальность проблемы. Успеиное развитие молекулярной биологии, разработка технологий получения рекомбинантных молекул ДНК, создание целого арсенала методов генетической инженерии растений открыли широкие возможности как для прикладных, так и для фундаментальных исследований растительных геномов. Тотипо-тентность растительных клеток и способность их геномов интегрировать чужеродные гены привели к тому, что за последние 10 лет с целью направленного изменения при^-аков более чем к 60 видам ра гений были применены методы генетической инженерии. Уже сейчас в лабораторных условиях можно получать растения, . устойчивые к насекомым-вредителям, к вирусным, бактериальным и грибным инфекциям, к пестицидам и гербицидам путем их биодеградации. Получены растения, несущие трансгены запасных белков сои, гороха, фосоли, кукурузы, ячменя, пшеницы и др. Однако успешное применение трансгенных растений в практи"еской селекции невозможно без проведения фундаментальных исследований, позволяющих проследить стабильность интеграции чужеродной генетической информации, экспрессию перенесенных генов в новом для них генетическом окружении, характер наследования трансгенов. Для большинства сельскохозяйственных культур, включая картофель (Solarium tuberosum L.), процессы взаимодействия между растительным геномом и интегрируемыми чужеродньми генами все еще недостаточно изучены, а имеющиеся в литературе данные о характере интеграции и экспрессии трансгенов противоречивы. Это и определило выбор наших исследований.
Цель и задачи исследования. Целью наших исследований явилось получение трансгенных растений у различных форм одной из наиболее важных в условиях Беларуси пищевой и кормовой культур" - картофеля Solanum tuberosum L. и изучение интеграции, экспрессии и наследования чужеродных бактериальных генов при вегетативном и репродуктивном размножении олучениых трансгенных форм.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
отработать условия эффективной регенерации растений из листовых дисков различных генотипов (сортов, гибридов, линий);
-
методом кокулітивации листовых дисков с использованием различных векторных систем получить трансгенные растения картофеля;
-
изучи-', эффективность получения трансгенных растений в зависимости от генотипа растения, а тагам; от использованной агробактериальной векторной системы;
-
провести молекулярно-генетический анализ на стабильность интеграции трансгенов при вегетативном и репродуктивном размножении полученных трансген"чх клонов;
-
проанализировать экспрессия трансгенов в F1 и F2 полученных трансгенных клонов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Отработаны условия агробактериальной трансформации картофеля Solanum tuberosum L., позволяющие получать грансгенные растения і ;я различных сортов, в том числе белорусской селекции.
Получены генетически маркированные трансгенные растения для восьми различных генотипов картофеля. Полученные трансгенные клоны, интегрировавшие бактериальные гены tt. tg, npt II, gus в различных комбинациях, могут служить модельными объектами для дальнейших фундаментальных исследований взаимодействия "растительный геном - трансген".
Впервые на картофеле показана интеграция трансгенов в две гомологичные хромосомы, причем оба локуса являются функционально активными.
Показано, что различные трансгенные клоны картофеля как в пределах одного генотипа (сорта, линии), так и между разными генотипами (сортами, линиями) могут сильно отличаться по уровню экспрессии чужеродного гена; уровень экспрессии тр:.;югена в геноме картофеля не имеет прямой связи с количеством его копий.
Наряду со стабильной интеграцией показаны случаи нестабильной интеграции трансгенов в геном картофеля..
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что для практического использования траксгенньк растений картофеля этап изучения модифицированного генома на стабильность интеграции желаемого трансгена и уровень его экспрессии является необходимым для каждого конкретного растения.
Основные положения диссертации, выносимые на гащиту. При агробактериальной трансформации картофеля эффективность получения тралсгень'" растений определяется как генотипом исходного растения, так и выбором векторной системы. Трансформанты картофеля отличаются между собой как п- количеству стабильно интегрированной чужеродной генетической информации, так и по уровню
- з -экспрессии траисгенов. При интеграции трансгена в две гомологичные хромосомы может наблюдаться з. |>екг усиления его фенотипичес-кого проявления.
Личный вклад соискателя. Работа выполнена Курочкиной С.Д. код руководством чл.-корр. АНБ, профессора Картеля Н.А. и при методической помощи ст.н.с, к.б.н. Забеньковой К.И. Плавмвдные вектора pGV941tt и p6V941tg сконструированы и любезно предоставлены сотрудниками ВНИИ СХВ РАСХН (г.Иосква).
Связь работы с крупными научными прграммами. Работа выполнялась в рамках теми, входящей в Республиканскую комплексную программу фундаментальных исследований "Генетические и физиоло-го-биохимические проблемы продуктивности и иммунитета сельскохозяйственных растений".
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуддались на I Всесоюзном и II Российском симпозиумах "Новые направления в биотехнологии , чтений", г. Пущино, 1991, 1993; на VI Съезде генетиков и селекционеров Беларуси, г.Горки, 1992; на конференции "Генетика соматических клеток в культуре", г.Черноголовка, 1993; на конференции "Стратегии и новые методы в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур" г.Жодино, 1994; на конференции "Генетическая инженерия и биотехнология", г.Минск,1994; на Международном семинаре "Современные направления в молекулярной биологии растений", г.Гатерслебен, Германия, 1994; на Международной конференции "Биотехнология растений и генетическая инженерия", г. Киев, 1994; на заседаниях Ученого Совета ИГиЦ АНБ.
Публикации. Результаты исследований опубликованы в 12 печатных работах, одна из которых за рубежом.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения н выводов, а также списка литературы. Работа содержит 22 ригунка, 8 таблиц. Список цитируемой литературы включает 234 наименования, в том числе 204 иностранных.