Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Работа актуальна в связи с острой необходимостью ограничить генетические последствия загрязнения биосферы химическими мутагенами. Генетическую безопасность могут обеспечить антимутагены, устраняющие или смягчающие мутагенные и канцерогенные эффекты средовых факторов. Их поиск и изучение проводятся во всем мире, однако, как правило, в тест-системах in vitro [Novick, Szilard, 1952; Clarke, Shankel, 1975; De Flora, Ramel, 1988]. Тема предусматривает организменный уровень исследований, что позволяет более точно прогнозировать действие антимутагенов в естественных условиях.
На современном этапе выделяются две крупные проблемы, изучение которых у высших эукариот, безусловно, способствует дальнейшему развитию теоретических и практических аспектов антимутагенеза: варьирование эффектов антимутагенов и механизмы их действия при химическом мутагенезе. Сейчас уже можно считать установленным фактом специфичность действия антимутагенов по отношению к различным мутагенам и тест-системам [Stich, 1991; Ferguson, 1994; Waters et a!., 1996]. Однако недостаточно данных, позволяющих оценить вклад внутриклеточной среды в модификацию химического мутагенеза и охарактеризовать закономерности этого процесса в половых клетках.
Известно, что антимутагены могут снижать частоту мутаций, взаимодействуя с мутагенами и их генотоксичными метаболитами, либо действуют опосредованным путем [Kada, 1985; De Flora, Ramel, 1988; Гончарова, 1990, 1993]. Среди опосредованных механизмов широко изучаются эффекты антимутагенов на биотрансформацию промутагенов / проканцерогенов [De Flora, Ramel, 1988; Stich, 1991; Журков, Сычева, 1993]. Не менее важным является подавление мутагенеза за счет повышения точности репликации и репарации ДНК. Значение последнего механизма особенно велико по отношению к мутагенам прямого действия, в том числе "супермутагенам", мизерного количества которых достаточно, чтобы вызвать заметный рост мутабильности. Модуляция репарационных процессов под влиянием антимутагенов исследуется не более 20 лет [Рапопорт и др., 1979; Засухина, 1979; Kuroda, Inoue, 1988], эта проблема практически не изучена в половых клетках.
Интенсивная хозяйственная деятельность, развитая химическая промышленность, последствия Чернобыльской катастрофы усиливают актуальность для Беларуси научных изысканий, направленных на контролирование мутационного процесса в окружающей среде, сохранение генофондов и уменьшение генетического риска для населения. Тема диссертации тесно связана с решением этих проблем.
Связь работы с крупными научными программами и темами. Работа выполнена в лаборатории антимутагенеза Института генетики и цитологии НАН Беларуси в рамках следующих тем: "Изучение закономерностей модифицирующего действия антимутагенов при различных мутагенных воздействиях на дрозофиле и
мышах" (№ гос. регистрации 01860021735); "Изучение закономерностей и механизмов подавления антимутагенами химического мутагенеза в половых и соматических клетках высших организмов" (№ гос. регистрации 0109010213); "Изучение антимутагенной активности некоторых антиоксидантов при химическом мутагенезе у дрозофилы и мышей" (№ гос. регистрации 1998161); "Изучение влияния биологически активных веществ - новых производных 1,4-дигидроизоникотиновой кислоты на функционирование репарационных систем животных организмов".
Перечисленные темы координировались государственными программами "Флора и Фауна", "Биологическое разнообразие", "Функционирование биосистем", а также входили в международную программу ЮНЕСКО "Человек и биосфера".
Цель и задачи исследования. Цель работы - выявление закономерностей модификации химического мутагенеза под влиянием антимутагенов и механизмов их действия у высших эукариот. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
-
Провести скрининг антимутагенов среди некоторых антиоксидантов и проанализировать проблемы тестирования веществ на антимутагенную активность в системах высших эукариот.
-
Изучить закономерности химического мутагенеза у высших эукариот на примере действия алкилирующего агента этилметансульфоната (ЭМС); оценить вклад определенных аддуктов и путей репарации ДНК в формирование ЭМС-индуцированных генных мутаций и разрывов хромосом.
-
Изучить влияние ряда антиоксидантов на ЭМС-индуцированный мутагенез в половых клетках дрозофилы и соматических клетках млекопитающих. Оценить эффективность антимутагенов, принадлежащих к различным химическим группам; выявить условия, способствующие проявлению их защитного действия.
-
Изучить влияние ряда антиоксидантов на репарацию ДНК при химическом мутагенезе у дрозофилы, для чего проанализировать: а) их влияние на материнскую репарацию первичных повреждений ДНК, индуцированных в зрелых сперматозоидах; б) зависимость эффектов от стадий сперматогенеза; в) чувствительность к антимутагенам половых клеток с полноценными и дефектными системами репарации.
5. На основании экспериментальных данных проанализировать механизмы
действия изученных антиоксидантов у высших эукариот, их связь с защитными
системами и репарацией ДНК.
Объект и предмет исследования. Основной объект исследований -Drosophila melanogaster. Использованы различные линии дрозофилы, в том числе мутанты с дефектами эксцизионной (mei-9) и пострепликативной (mei-41) репарации. Часть экспериментов выполнена на гибридных мышах СВА *C57Bl/6j.
Предмет исследования - антимутагены как средства снижающие частоту спонтанных и индуцированных мутаций; мутационный процесс и репарация ДНК.
Гипотеза. Модификация химического мутагенеза с помощью антимутагенов рассматривается как сложный многокомпонентный процесс, важнейшей составляющей которого является обусловленная генотипом внутриклеточная и организ-менная среда. Благодаря множественным механизмам действия антимутагены вмешиваются в мутационный процесс на разных этапах. В условиях целостного организма приоритетными являются опосредованные механизмы, в том числе влияние на репарацию ДНК.
Методология и методы проведенного исследования. Методология исследования основана на таких общебиологических явлениях, как материнский эффект, эффект хранения, зависимость метаболической и репарационной активности клеток от стадий сперматогенеза или развития организма. Оценивался мутационный ответ половых и соматических клеток целостного организма, который подвергался мутагенному и/или антимутагенному воздействию.
В половых клетках дрозофилы учитывали рецессивные сцепленные с полом летальные мутации (РСПЛМ); разрывы хромосом, вызывающие эмбриональную (ЭЛ), в том числе позднюю (ПЛ), постэмбриональную (ПЭЛ) и суммарную (СЛ) летальность потомков в онтогенезе, а также потери половых хромосом (ППХ). Как правило, различные типы мутаций анализировали в потомстве одних и тех же родителей, т.е. при строго идентичных условиях эксперимента. Индивидуальный анализ потомства каждого обработанного самца давал возможность оценить частоту мутаций в пуле половых клеток как всех, так и отдельных особей.
Кластогенные эффекты дополнительно оценивали по частоте микроядерных (МЯ) полихроматофильных эритроцитов в костном мозге взрослых мышей (самцов и самок) и печени эмбрионов.
Научная новизна и значимость полученных результатов:
-
Выявлен новый класс антимутагенов - производные 1,4-дигидропиридина (1,4-ДГП). Антимутагенная активность этих соединений определяется отсутствием радикала или наличием карбоксилат-аниона в 4-м положении циклической структуры. Впервые установлена тесная корреляция между эффективностью антимутагенного действия производных 1,4-ДГП и их электронодонорной способностью.
-
Впервые продемонстрирован существенный вклад пострегашкативной репарации в формирование ЭМС-индуцированных разрывов хромосом. Показана зависимость частоты ЭМС-индуцированных генных мутаций не только от стадии сперматогенеза, но и от генотипа самцов: сперматогонии самцов yellow более чувствительны к действию алкилирующего агента по сравнению с клетками дикого типа.
-
Впервые охарактеризовано действие антимутагенов в зависимости от многих факторов, включая изменения внутриклеточной среды на разных стадиях развития организма и сперматогенеза. Установлено, что обработка личинок способствует реализации защитного потенциала, тогда как обработка имаго вызывает разнона-
правленные эффекты антимутагенов. Эти закономерности свидетельствуют о том, что в условиях целостного организма защитное действие антиоксидантов против этилметансульфоната реализуется преимущественно опосредованным путем.
4. Впервые установлено, что производные 1,4-дигидроизоникотиновой кислоты (1,4-ДГИНК) наряду с некоторыми другими антиоксидантами модулируют репарационные процессы при химическом мутагенезе в половых клетках.
Полученные результаты представляют интерес для дальнейшей разработки нового структурно-функционального подхода к поиску антимутагенов. Они вносят существенный вклад в развитие фундаментальных представлений о модификации химического мутагенеза под влиянием антимутагенов, выявляя сложность и много-компонентность этого процесса у высших эукариот. Получили дальнейшее развитие представления о специфичности и механизмах действия антимутагенов. Высокой степенью новизны обладает экспериментальное доказательство влияния антимутагенов на репарацию ДНК в половых клетках, что дает возможность вмешиваться в химический мутагенез на завершающем этапе (после формирования адцук-тов ДНК), ожидая положительного эффекта не только у данного индивидуума, но и у его потомства.
Практическая значимость полученных результатов состоит в следующем:
-
Среди производных 1,4-ДГП обнаружены антимутагены, существенно подавляющие спонтанный и химический мутагенез у высших эукариот. При оптимальных условиях их защитное действие проявляется в широком диапазоне доз, а по эффективности они значительно превосходят другие изученные антиоксиданты (аминотиоловые соединения, производные фенола, облепиховое масло). Особенно ценно то, что антимутагенная активность обнаружена у лекарственных препаратов (дилудина, глутапирона), что расширяет спектр их практического применения.
-
Предложен критерий поиска антимутагенов среди антиоксидантов и некоторые рекомендации по тестированию антимутагенов. На фоне спонтанного мутационного процесса необходимо использовать тест-системы с достаточной разрешающей способностью, к которым можно отнести учет рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ) у дрозофилы. Характерно, что этот тест чувствителен не только к антимутагенным, но и комутагенным эффектам.
-
Установлены особенности действия антимутагенов, имеющие принципиальное значение для разработки стратегии практического применения антимутагенов.
-
Показано, что некоторые изученные антиоксиданты могут быть использованы в качестве репарогенов, способствующих восстановлению поврежденной ДНК.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Антимутагенное действие изученных производных 1,4-ДГП обусловлено химической структурой, обеспечивающей высокую антиоксидантную и электроно-донорную активность этих соединений. Антимутагены этой группы in vivo сущест-
венно подавляют уровень спонтанного и химического мутагенеза в половых клетках дрозофилы, а также снижают кластогенный эффект алкилирующего агента в соматических клетках мыши. При оптимальных условиях их защитное действие проявляется в широком диапазоне доз (10-250 мМ), а эффективность выше, чем у других изученных антиоксидантов.
-
В половых клетках дрозофилы генетическая активность антиоксидантов варьирует от антимутагенной до комутагенной, отражая специфичность действия антимутагенов. Защитный эффект антиоксидантов преимущественно проявляется в условиях, исключающих их химическое или физическое взаимодействие с мутагеном, предопределяя приоритетность опосредованных механизмов антимутагенного действия в условиях целостного организма.
-
Закономерности становления генных мутаций и разрывов хромосом под влиянием этилметансульфоната обусловлены аддуктами ДНК. Динамика накопления разрывов хромосом соответствует скорости депуринизации ДНК в результате спонтанного гидролиза 7-этилгуанина. Пострепликативная репарация может вносить вклад в ЭМС-кластогенез. Частота ЭМС-индуцированных генных мутаций зависит от стадии сперматогенеза и генотипа самцов.
-
Антимутагены влияют на материнскую репарацию первичных повреждений ДНК, индуцированных ЭМС в сперматозоидах дрозофилы. Защитный эффект глу-тапирона проявляется также на премейотических стадиях сперматогенеза. Дефекты репарации снижают чувствительность половых клеток к антимутагенам. Антиокси-данты способны модулировать репарацию ДНК при химическом мутагенезе в половых клетках.
-
У высших эукариот модификация мутационного процесса антимутагенами представляет результат взаимодействия трех составляющих: химического мутагенеза, антимутагенеза и обусловленной генотипом внутриклеточной среды, которая существенно влияет на реализацию защитного потенциала антимутагенов.
Личный вклад соискателя. Постановка задач, выбор подходов к изучению интересующих проблем, анализ данных и все теоретические разработки выполнены лично соискателем. Экспериментальный материал получен совместно с сотрудниками лаборатории антимутагенеза Института генетики и цитологии НАН Беларуси А.Б. Левиной, О.В. Даливеля, СП. Забрейко, Н.В. Савиной. Для статистического анализа результатов использован пакет прикладных программ AB-STAT, а также специальные программы для персонального компьютера, созданные к.б.н. Б.Ю. Аношенко.
Автор выражает искреннюю благодарность зав. лабораторией антимутагенеза д.б.н. Р.И. Гончаровой, идеи которой нашли отражение и дальнейшее развитие в этом исследовании. Автор глубоко признателен всем участникам работы за творческое сотрудничество, помощь и дружескую поддержку.
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации представлялись на VI Всесоюзном совещании по проблемам биологии и генетики дрозофилы (Одесса, 1989), на II и IV конференциях "Биоантиоксидант" (Москва, 1986, 1992), на заседаниях Секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" (Орджоникидзе, 1986; Ереван, 1987; Самарканд, 1990), научно-практической конференции стран Балтии и СНГ по проблемам антимутагенеза (Минск, 1993), на международном симпозиуме "Мутагены и канцерогены окружающей среды и наследственность человека" (Москва, 1994), съездах ВОГИС и БОГИС (Минск, 1992, Горки, 1992; 1997), республиканской конференции "Современные проблемы генетики и селекции" (Минск, 1995 г.), IV международной конференции по механизмам антимутагенеза и антиканцерогенеза (Канада, 1994 г.) и совещании Ирландской секции биохимического общества (Coleraine, 1996).
Опубликованность результатов.
Результаты исследований опубликованы в 30 статьях, а также материалах международных и республиканских конференций (всего 70 публикаций). В 1999 г. издана монография "Антимутагены и химический мутагенез в системах высших эука-риот" (267 с).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 7 глав и заключения. Полный объем диссертации 240 стр, рисунков 27, таблиц 54, список использованных источников насчитывает 661 наименование.