Введение к работе
Актуальность темы. Почвенные, ризосферные и эпифнтные бактерии - широко распространенная и важная в научном и практическом отношении группа микроорганизмов, способная оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на развитие сельскохозяйственных культур. Некоторые виды этих бактерий являются фитопатогенными, другие же оказывают стимулирующее действие на развитие растений. Предполагается, что патогенность и стимуляция роста растений могут быть обеспечены за счет прямого действия фитогормонов, секретируемых данной группой микроорганизмов.
Актуальность изучения этих проблем определяется ролью фитогормонов в индукции развития бактериального рака и других патологических новообразований у растений, а также в установлении симбиотических взаимоотношений в системе бактерия-растение. Изучение бактериальных генов синтеза фитогормонов в сравнительно-эволюционном аспекте открывает возможность для более глубокого понимания механизмов сложившихся взаимодействий микроорганизмов с растениями. Выяснение биологического смысла этого явления представляет значительный интерес для фундаментальных исследований, направленных на вскрытие эволюционных связей генов фитогормонов растительного и микробного происхождения. Вместе с тем, выявление микробов-продуцентов фитогормонов расширяет возможности создания искусственных биоценозов, обеспечивающих повышение продуктивности экономически значимых сельскохозяйственных культур.
Отдельной проблемой является поиск новых, эффективных путей борьбы с онкозаболеваниями сельскохозяйственных культур, инфицируемых ИУК-синтезирующими фитопатогенами. Эта проблема остается до настоящего времени нерешенной. В этой связи особое внимание привлекают плазмиды, которые при введении в клетки некоторых фитопатогенов подавляют их онкогенность. Использование такого рода взаимодействий может оказаться перспективным для защиты растений от бактериального рака и других патологических гиперплазии растительных тканей.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнялась в рамках научно-исследовательских тем:
«Изучение структурно-функциональной организации генома растений и его модификации при воздействии чужеродного генетического материала», 1986-1990 г.г., № гос. регистрации 01860021738, программа 04 «Сельское хозяйство»;
«Изучение молекулярной структуры геномов зерновых культур на основе молекулярно-генетических маркеров; разработка систем конструи-
рования трансгенных растений», 1990-1994 г.г., № гос. регистрации 1995149, программа 01 «Продуктивность растений»;
«Молекулярно-генетическое изучение организации экспрессии геномов сельскохозяйственных культур с помощью ДНК-зоидов и генетической трансформации», 1995-1999, № гос. регистрации 1995858, программа 01 «Биопродуктивность растений».
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение способности продуцировать природный ауксин, индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) различными почвенными, ризосферными и эпи-фитными бактериями, включая фитопатогенные и непатогенные формы; установление возможных корреляций между способностью синтезировать ИУК и другими свойствами исследуемых микроорганизмов; изучение путей и генетических детерминантов синтеза ИУК.
В соответствии со сформулированной целью решались следующие экспериментальные задачи:
- скрининг штаммов почвенных, ризосферных и эпифитных
(фитопатогенных, сапрофитных и симбиотических) бактерий на продук
цию ИУК;
количественная оценка продукции ИУК у отобранных в результате скрининга штаммов;
выявление корреляции между способностью бактерий синтезировать ИУК, их видовой принадлежностью и фитопатогенностью;
изучение влияния плазмиды R388 из группы несовместимости Inc W на синтез ИУК у некоторых бактерий;
изучение путей биосинтеза ИУК через ИАМ с использованием в качестве ДНК-зондов клонированных генов синтеза ИУК из Т-ДНК Ті -плазмид Agrobacterium tumefaciens, и определением активности фермента оксидазы, участвующего в обходном пути образования ИУК;
идентификация плазмид у бактерий, продуцирующих ИУК, с целью первичного определения локализации генов синтеза ИУК.
Объект и предмет исследования. Объектом исследования являлись фитопатогенные и непатогенные почвенные, ризосферные и эпифитные бактерии родов Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Corynebacterium, Bacillus, Enterobacter, Azospirillum и Rhizobium и группы неидентифициро-ванных бактерий семейства Rhizobiacea.
Предмет исследования - способность перечисленных выше микроорганизмов синтезировать фитогормон ИУК; генетические детерминанты и биохимические пути синтеза ИУК у бактерий-продуцентов; корреляции между способностью синтезировать индолил-3-уксусную кислоту и другими свойствами исследуемых микроорганизмов.
Методология и методы проведенного исследования. Для определения продукции ИУК в работе использовались методы качественного ана-
лиза в модификации Тэннера, Андерсена (Тшшег & Anderson, 1964), и количественного анализа по Гордону и Веберу (Gordon & Weber, 1951).
Определение пектатлиазной активности бактерий проводилось методом Logan (1963).
Определение активности фермента TSO проводили методом Oberhansii et al., (1991).
Для выделения, анализа и трансформации тотальной и плазмидной ДНК использовали методы Мида (Meade et al., 1982), Бирнбойма к Доли (Birnboim, Doly, 1979), Краева (1990), Манделл и Хига (Mandel & Higa, 3970). При изучении пути биосинтеза ИУК через ИАМ использовали по-лимеразную цепную реакцию (ГЩР), ДНК-ДНК гибридизации согласно Sambrook et al,, (1989) и тонкослойную хроматографию (Hartmarm et al., 1983). Для анализа бактерий на присутствие плазмид использовали метод Экхарда (Eckhard, 1978).
Научная новизна полученных результатов.
-
Впервые систематически на предмет синтеза индолил-3-уксусной кислоты исследована большая коллекция почвенных, ризосферных и эпи-фитных бактерий, как фитопатогенных так сапрофитных и симбиотиче-ских, включающая 1318 штаммов, относящихся к восьми родам и группе бактерий семейства Rhizobeaceae, Показано, что ИУК-продуцирующая способность является свойством, присущим широкому ряду бактерий, независимо от их таксономической принадлежности и характера взаимодействия с растениями.
-
Сконструирована плазмида pTV15, содержащая фрагмент гена tms-\ Agrobacterium tumefaciens {iaaM), пригодная для массового тестирования бактерий на наличие нуклеотидных последовательностей, гомологичных гену iaaM, кодирующему первый фермент превращения триптофана в индолил-3-уксусную кислоту - индолил-3-моноокситеназу.
3. Для штаммов бактерий видов Psendomonas cichorii, P.
saccharophila, Xanlhomonas campestris pv vesicatoria, X. campestris pv
malvacearum, X. campestris pv translucens, Erwinia carotovora pv carotovora,
Corynebacterium michiganense, С insidiosum, C. sepedonicvm, показано, что
одним из путей биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты является путь че
рез индолил-3-ацетамид.
-
Выявлена корреляция между фигопатогенностью исследованных бактерий и их способностью использовать индолил-3-ацетамид в качестве предшественника ИУК.
-
Впервые для некоторых псевдомонад обнаружено свойство су-прессировать продукцию ИУК гшазмидой R388.
Практическая значимость полученных результатов. Предложенные в работе методы выявления бактерий с высокой продукцией ИУК могут найти широкое практическое использование в решении задачи стиму-
ляции роста растений, поскольку микробные фитогормоны имеют ряд преимуществ перед химическими регуляторами роста: они быстро связываются и используются растительной клеткой и являются препаратами мягкого действия. С этой точки зрения промышленное использование штаммов-продуцентов фитогормона является весьма перспективным.
В целом, полученные в работе результаты создают предпосылки для дальнейших более детальных исследований, направленных на выяснение общих закономерностей структурно-функциональной организации генетических систем, контролирующих синтез фитогормона индолил-3-уксусной кислоты. Эти результаты могут быть также использованы для конструирования новых штаммов с заданными свойствами с целью изучения взаимодействия микроорганизмов и растений.
Изучение взаимоотношений микроорганизмов с растениями может способствовать разработке биологических методов борьбы с болезнями растений: а) получение конкуректноспособных непатогенных штаммов из фитопатогенных; б) использование штаммов, гиперпродуцентов фитогормона, в смеси с бактериальными препаратами, обладающими антипатогенным действием.
Дериваты Agrobacterhim tumefaciens, несущие антионкогенную плаз-миду R388, могут быть использованы в качестве потенциального средства для биологической защиты некоторых двудольный растений от бактериального рака.
Изучение генетических детерминант синтеза фитогормонов открывает дополнительные перспективы для получения бактерий, суперпродуцентов этих соединений. При этом выявление биохимического пути биосинтеза ИУК тем или иным микроорганизмом и выяснение взаимосвязи между способом образования этого фитогормона и типом взаимодействия микроорганизмов с растениями создает возможности для направленного использования пололштельных воздействий микроорганизмов на растения (таких как стимуляция роста и повышение продуктивности) и вместе с тем позволяет разрабатывать принципиально новые подходы для защиты растений от фитопатогенов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
свойство продуцировать фитогормон ИУК широко распространено среди бактерий как фитопатогенных, так и непатогенных, как близкородственных, так и филогенетически далеко отстоящих друг от друга;
существует корреляция между способностью продуцировать ИУК бактериями и их таксономической принадлежностью, и отсутствует взаимосвязь между фитопатогенностью бактерий и способностью продуцировать фитогормон;
у большинства исследованных фитопатогенных бактерий путь биосинтеза ИУК происходит через интермедиат индолил-3-ацетамид и детер-
минируется генами с преимущественной локализацией в составе хромосомы;
- введение плазмиды R388 из группы несовместимости Inc W в бактерии Pseudomonas, отличающиеся высоким уровнем синтеза ИУК, су-прессирует функцию генов, контролирующих биосинтез ИУК.
Личный вклад соискателя. Основные результаты диссертации получены непосредственно соискателем в лаборатории молекулярной генетики Института генетики и цитологии НАН Беларуси.
Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы докладывались на YI и YII съездах Белорусского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Минск, 1992 и 1997); Всесоюзной конференции молодых ученых (Уфа, 1992); Республиканских конференциях «Генетическая инженерия и биотехнология» (Минск, 1994); «Современные проблемы генетики и селекции» (Минск, 1995); Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» (Минск, 1998).
Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе три статьи с общим количеством страниц -18.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы (4 раздела), описания материалов и методов исследования (2 раздела), изложения результатов и их обсуждения (6 разделов), заключения, списка цитируемой литературы (183 источника) и приложения. Работа изложена на 116 страницах, содержит 12 рисунков и 18 таблиц.