Введение к работе
Актуальность темы:
В настоящее время генетическая инженерия из комплекса методов, применяемых в молекулярно-биологических и генетических исс- ледованиях, становится средством развития промышленной биотехнологии. На основе различных микроорганизмов созданы эффективные генно-инженерные штаммы-продуценты биологически активных соединений.
Значительную долю продукции биотехнологии составляют аминокислоты аспарагинового семейства -лизин и треонин. Традиционными продуцентами этих аминокислот являются глутаматпродуцирующие ко-ринебактерии. Штаммы коринебактерий, используемые в промышленности, получены традиционными селекционными методами.
Развитие систем клонирования для глутаматпродуцирующих кори-небактерий, клонирование и изучение экспрессии генов непосредственно в клетках коринебактерій позволит ускорить процесс создания новых и улучшенных суперпродуцирующих промышленных штаммов используемых в производстве аминокислот.
Амплификация в клетках коринебактерий генов, кодирующих ферменты лимитирующих этапов биосинтеза аминокислот, может приводить к перераспределению аминокислотной продукции в пользу необходимого продукта и является путем к созданию суперпродуцентов аминокислот.
Из выше сказанного очевидна необходимость развития систем вектор-хозяин для коринебактерий и изучения экспрессии клонированных генов биосинтеза аминокислот. Цели работы:
поиск и характеристика маркеров и репликонов пригодных,1 для генно-инженерных работ в системе Е. ooli/C. glutamioum I
разработка системы вектор-хозяин для лабораторных и промышленных штаммов коринебактерий
конструирование бирепликонных челночных векторов Е. ООІ1/ С. glutamioum, отработка метода введения их в клетки коринебакте-
рий
клонирование на полученных векторах генов биосинтеза треонина коринебактерий и Е. ооН изучение экспрессии клонированных генов непосредственно в клетках коринебактерий.
определение стабильности вектора в клетках коринебактерий и рекомбинантных ДНК на его основе
создание методами генной инженерии коринебактериального штамма продуцента с характеристиками превосходящими таковые у используемых в промышленности
Научная новизна работы:
В работе сконструированы бирешшконные плазмиды Е. ooli/ с. glutamloum, использованные в качестве векторов для коринебактерий. Разработана система трансформации клеток коринебактерий с использованием ДНК-нагруженных липосом. На бирешшконных плазми-дах клонированы гены thrA Е. ooli и thrA2 С.glutamloum АТСС13032, ген а-амилазы Baolllus amyloliquefaoiens, гены thrA2* и thrB в. flavum 61-5 и изучена их экспрессия в клетках коринебактерий. Разработан метод массового экспресс анализа продуктов клонированных генов в миниклетках инфицированных рекомбинантными фазмидами. Практическая ценность:
Разработан метод трансформации клеток коринебактерий с помощью ДНК-нагруженных липосом. который может быть применена для различных микроорганизмов.
- Рекомбинантные ДНК на основе сконструированного вектора стабильно поддерживаются в с. glutamloum без селекции по антибиотику.
Введение гена thrA2* В. flavum 61-5 в составе сконструированных векторных плазмид в клетки штаммов коринебактерий с мутацией по гену thrB приводило к увеличению уровня продукции гомосе-рина до 26 г/л на мелассных средах.
Структура работы. Рукопись диссертации состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов,выводов, списка литературы. Работа содержит т36 страниц ма-винописного текста, 10 рисунков,- II таблиц. Библиография включает ПО литературных источников. Апробация. Результаты работы докладывались на Всесоюзной'конфе-