Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1. Эпидемиология почечно-клеточной карциномы 12
1.1.1 Классификация почечно-клеточных карцином 13
1.1.2 Этиология почечно-клеточных карцином 18
1.2 МикроРНК – эпигенетические регуляторы экспрессии генов 23
1.2.1 Секреторные микроРНК 23
1.2.2 Стабильность микроРНК 24
1.2.3 МикроРНК как биомаркеры при онкологических заболеваниях 25
1.2.4 Участие микроРНК в развитии почечно-клеточных карцином 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 34
2.1 Материалы исследования 34
2.2 Молекулярно-генетические методы исследования 36
2.2.1 Забор образцов периферической крови и биопсии 36
2.2.2 Выделение геномной ДНК и тотальной РНК 36
2.2.3 Анализ экспрессии генов микроРНК с использованием технологии OpenArray чипа на приборе Quant Studio12K Flex Realime PCR System 37
2.2.4 Метилчувствительная ПЦР с использованием набора EpiTect Methyl II PCR Array 42
2.2.5 Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК с использованием технологии OpenArray чипа на приборе Quant Studio12K Flex Realime PCR System 43
2.2.6 Метод дискриминации аллелей TaqMan 44
2.2.7 Статистическая обработка результатов 45
2.2.8 Дизайн исследования 47
Глава 3. Результаты и обсуждение 52
3.1 Анализ экспрессии 758 генов микроРНК в опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхиме пациентов со светлоклеточным раком почки 52
3.2 Анализ метилирования 22 генов микроРНК в опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхиме пациентов со светлоклеточным раком почки 59
3.3 Анализ ассоциации генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК с риском развития почечно-клеточных карцином 68
3.4 Анализ ассоциации генотипов и аллелей полиморфных вариантов в сайтах связывания микроРНК генов VHL-HIF-зависимого пути с риском развития почечно-клеточных карцином 88
3.5 Анализ ассоциаций сочетаний аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК и полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК генов VHL-HIF1-зависимого пути с риском развития светлоклеточного рака почки 93
Заключение 98
Выводы 103
Список сокращений и условных обозначений 105
Список литературы 106
Приложение А – Характеристика пациентов и индивидов из контрольной группы, включенных в исследование 126
Приложение Б – Результаты анализа экспрессии генов микроРНК 131
Приложение В – Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов биогенеза и предшественников микроРНК 132
Приложение Г – Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов, располагающихся в сайтах связывания микроРНК генов VHL-HIF-зависимого пути 152
- Этиология почечно-клеточных карцином
- Участие микроРНК в развитии почечно-клеточных карцином
- Анализ ассоциации генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК с риском развития почечно-клеточных карцином
- Анализ ассоциаций сочетаний аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК и полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК генов VHL-HIF1-зависимого пути с риском развития светлоклеточного рака почки
Этиология почечно-клеточных карцином
На сегодняшний день выявлено большое число потенциальных этиологических факторов, которые могут способствовать развитию ПКК. Среди факторов риска развития ПКК можно выделить курение, артериальную гипертензию, ожирение, наличие других почечных патологий, сахарный диабет, прием лекарственных препаратов и профессиональные факторы. В настоящее время курение сигарет является установленным фактором риска развития светлоклеточной карциномы почек. Метаанализ, включающий 26 эпидемиологических исследований, проводимых в течение 37 лет, показал, что риск возникновения скПКК среди курильщиков примерно на 40% выше по сравнению с людьми, которые никогда не курили (Eckel-Passow et al., 2014).
Несмотря на то, что курение является установленным фактором риска для скПКК, остается неясным, какие специфические соматические молекулярные изменения лежат в основе этой хорошо известной ассоциации. Идентификация конкретных изменений на клеточном уровне, которые связывают курение с развитием скПКК, может еще больше укрепить причинно-следственную связь, способствовать пониманию этиологии этого заболевания. Кроме того, современные исследования показали, что курение оказывает влияние на развитие ПКК определенных морфологических типов. Эти результаты подчеркивают различия в канцерогенных механизмах, лежащих в основе различных подтипов карциномы почек (Patel et al., 2015). Исследование факторов риска развития ПКК в Великобритании показало, что 42% случаев обусловлены курением и избыточной массой тела (47% у мужчин и 34% у женщин)(Parkin, Boyd, Walker, 2011).
Современные данные подтверждают гипотезу о том, что ожирение может увеличить риск развития рака почки, что указывает на важную роль ожирения в инициировании и прогрессировании этого новообразования. Однако патология, лежащая в основе ассоциации между ожирением и повышенным риском развития рака почки, остается неясной. В настоящее время предложено несколько механизмов, один из которых предполагает участие инсулина и инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), который, как известно, обладает сильным опухоль-стимулирующим эффектом. Кроме того, в экспериментальных моделях было показано, что перекисное окисление липидов, которое повышено у людей с ожирением, вовлечено в развитие рака почек. Было продемонстрировано, что перекисное окисление липидов проксимальных почечных канальцев является необходимым механистическим путем в химически индуцированном канцерогенезе почек. Показано, что побочные продукты перекисного окисления липидов взаимодействуют с ДНК с образованием аддуктов, которые впоследствии могут вызвать ее повреждение. Это, в свою очередь, может приводить к мутациям в протоонкогенах и/или генах-супрессорах опухоли и приводить к превращению нормальной клетки в клетку со злокачественным фенотипом (Golabek et al., 2015).
Наряду с избыточной массой тела, фактором риска развития рака почки является артериальная гипертензия. Причем ожирение и гипертония, в некоторой степени, могут представлять собой общий причинный механизм развития рака почек. Ожирение связано с увеличением скорости клубочковой фильтрации и повышенным потоком почечной плазмы, что может сделать почку более восприимчивой к повреждениям и канцерогенезу. Кроме того, у пациентов с гипертонией наблюдается хроническая почечная гипоксия, вызванная повышением уровня гипоксия-индуцируемых факторов, которые, в свою очередь, могут играть роль в онкогенезе. И ожирение, и гипертония также связаны с окислительным стрессом и перекисным окислением липидов, который, как предполагается, играет роль в этиологии рака почки (Sanfilippo et al., 2014).
Кроме того, было изучено много других факторов риска, таких как медикаментозное лечение, сахарный диабет 2 типа, потребление алкоголя, диета и заболевание почек, но эти данные достаточно противоречивы. Так, например, при изучении связи потребления мясных продуктов и риска развития ПКК, было показано, что потребление красного мяса может способствовать возникновению опухолей почки у женщин (Rohrmann et al., 2015). Интересные данные были получены в ходе исследования влияния алкоголя на риск возникновения почечно-клеточных карцином. В ряде работ сообщается, что умеренное употребление алкоголя было ассоциировано со снижением риска развития рака почки (Wozniak et al., 2015). Было предложено несколько механизмов, с помощью которых алкоголь может снизить риск развития ПКК, к ним можно отнести: повышенную чувствительность к инсулину, снижение окислительного стресса, поскольку алкогольные напитки содержат фенольные соединения с антиоксидантом и могут удалять окисленные канцерогенные агенты, снижать перекисное окисление липидов и пролиферацию клеток и способствовать апоптозу, и диуретический эффект алкоголя, который может помочь контролировать гипертонию (Lew et al., 2011).
Рак почки традиционно считается не профессиональным заболеванием. Тем не менее, были проведены многочисленные исследования для изучения того, связаны ли химические вещества или различные виды воздействия окружающей среды с развитием рака почки. Во многих эпидемиологических исследованиях более высокий риск развития ПКК отмечается у работников, занятых в области сельского хозяйства, что может объясняться воздействием пестицидов, а также других потенциально канцерогенных веществ, включая хлорированные растворители, металлы, удобрения, выхлопные газы двигателей, вирусы животных и микроорганизмы (Karami et al., 2012). Наиболее убедительными являются исследования промышленного растворителя трихлорэтилена, продемонстрировавшего в нескольких исследованиях с относительно небольшим количеством пациентов повышенный риск развития злокачественных опухолей почки, однако, необходимы более масштабные исследования для подтверждения этих результатов (Mariusdottir et al., 2016).
Участие микроРНК в развитии почечно-клеточных карцином
Современные исследования, использующие технологии микроРНК-специфичных микрочипов и секвенирования РНК, показали, что эти малые молекулы играют центральную роль в нормальной физиологии клеток почек, и изменения в их регуляции широко распространены при ПКК. Количество экспериментально подтвержденных, физиологически значимых микроРНК увеличивается с каждым годом, и, по мнению экспертов, тысячи функциональных микроРНК еще предстоит идентифицировать (Morris, Latif, 2017). Хотя их важность очевидна, многие вопросы, касающиеся взаимодействия между микроРНК, мРНК и белками при нормальной клеточной физиологии и развитии злокачественных опухолей, еще предстоит выяснить. Изменение экспрессии и процессинга микроРНК играет ключевую роль при формировании опухоли (Holoch, Moazed, 2015). За последние 10 лет глобальный скрининг экспрессии микроРНК при ПКК показал, что экспрессия большого количества микроРНК снижена, либо полностью отсутствует в опухолях почек, по сравнению с нормальной тканью. Кроме того, снижение экспрессии микроРНК часто ассоциировано с метилированием промотора или изменением количества копий гена (Juan et al., 2010; Osanto et al., 2012).
В патогенезе почечно-клеточных карцином особое внимание уделяется ряду генов-супрессоров опухолевого роста, участвующих в подавлении активности онкогенов. Известно, что изменение активности данных генов может приводить к развитию и прогрессированию опухоли. Порядка 70% спорадических случаев светлоклеточного рака почки сопровождается инактивацией гена фон Хиппеля-Линдау (VHL, von Hippel–Lindau), расположенного на коротком плече хромосомы 3 в области 3p25 (Audenet et al., 2012). Герминальные мутации данного гена приводят к синдрому фон Хиппеля-Линдау c аутосомно-доминантным типом наследования (Latif et al., 1993). Основной функцией VHL, подавляющей развитие опухоли, является опосредование деградации гипоксией индуцированного фактора (HIF), который стимулирует экспрессию множества генов-мишеней с онкогенными функциями (Vanharanta et al., 2013), таких как VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) и PDGFB (фактор роста тромбоцитов), а также митогенные факторы, такие как TGF (трансформирующий фактор роста) (Kondo et al., 2002). На сегодняшний день установлен ряд микроРНК, непосредственно участвующих в регуляции генов VHL-HIF пути. Так, показано, что pVHL индуцирует экспрессию микроРНК-30c-2-3p и микроРНК-30a-3p, мишенями для деградации которых являются транскрипты HIF2. Потеря pVHL приводит в этом случае к снижению экспрессии данных микроРНК. При этом, сниженная экспрессия микроРНК-30c-2-3p или микроРНК-30a-3p демонстрировала значимую связь с плохим прогнозом у пациентов со светлоклеточным раком почки, свидетельствуя о важной роли данных микроРНК для процессов роста и прогрессирования заболевания (Mathew et al., 2014).
Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является регулятором ангиогенеза и ключевой транскрипционной мишенью HIF. Установлено, что уровни белка VEGF контролируются микроРНК-206 и микроРНК -106a-5p, экспрессия которых часто понижается при скПКК (Kurozumi et al., 2017).
Известно также, что наиболее часто в условиях гипоксии происходит изменение уровней микроРНК-210. Данная микроРНК регулируется как HIF-1 (Camps et al., 2008; Huang et al., 2009), так и HIF-2 (Zhang et al., 2009). МикроРНК-210 играет важную роль в клеточном ответе на гипоксию, например, в апоптозе (Kulshreshtha et al., 2007), ангиогенезе (Fasanaro et al., 2008), регуляции клеточного цикла (Giannakakis et al., 2008), восстановлении повреждений ДНК (Crosby et al., 2009), метаболизме митохондрий (Chan et al., 2009) и росте опухоли (Volinia et al., 2006). В исследовании Zhao с соавт. было показано, что экспрессия микроРНК-210 повышена в сыворотке крови пациентов с ПКК по сравнению со здоровыми индивидами. Кроме того, уровень экспрессии микроРНК-210 в сыворотке пациентов значительно снижался после хирургического удаления опухоли (Zhao et al., 2013), что говорит о возможности использования данной микроРНК в качестве диагностического маркера.
МикроРНК-155, вовлеченная в гипоксический ответ, играет определенную роль в качестве компонента сети отрицательных обратных связей, который управляет трансляцией HIF-1a. При светлоклеточной ПКК часто наблюдается повышенная экспрессия данной микроРНК в опухолях по сравнению с нормальной тканью, кроме того повышение экспрессии коррелирует с увеличением размера опухоли (Dias et al., 2013).
Потеря белка VHL приводит также к активации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Этот рецептор представляет собой мембранный гликопротеин, который принадлежит к семейству рецепторов тирозинкиназы ErbB. EGFR активирует несколько сигнальных путей, включая пути MAPK/ERK и PI3K/AKT. Эти пути способны модулировать генетическую транскрипцию, стимулировать клеточную пролиферацию, миграцию, инвазию, ангиогенез и ингибировать апоптоз. В литературе описано большое число микроРНК, вовлеченных в EGFR-путь, экспрессия которых изменяется при ПКК (Dias et al., 2013). Так, мишенями микроРНК-21 являются гены, вовлеченные в регуляцию клеточного цикла, например TP53. Было также показано, что микроРНК-21 индуцирует опухолевый ангиогенез, воздействуя на PTEN, что приводит к активации AKT и ERK1/2 сигнальных путей и повышению экспрессии HIF-1a и VEGF. Деградацию PTEN также вызывают две микроРНК: микроРНК-221 и микроРНК-222, вовлеченные, кроме того, в процесс метастазирования (Garofalo et al., 2009; Zhang et al., 2012a).
В исследовании von Brandenstein с соавт. описана микроРНК-15а как опухолевый супрессор, способствующий апоптозу и ингибированию клеточной пролиферации через тесное взаимодействие с альфа изоформой протеинкиназы С (PKC). На молекулярном уровне PKC подавляет высвобождение из ядра пре-микроРНК-15а путем прямого взаимодействия молекул. Снижение уровня PKC приводит к повышению экспрессии микроРНК-15а. Недавно было показано, что усиление экспрессии микроРНК-15а может быть важным маркером различия между доброкачественной и злокачественной светлоклеточной ПКК (Brandenstein von et al., 2012).
Таким образом, накопленные данные о роли микроРНК в развитии злокачественных новообразований достаточно обширны. Известно, что профили экспрессии микроРНК специфичны как для различных типов гистологически нормальных, так и опухолевых тканей. Однако результаты исследований, существующих на сегодняшний день, достаточно противоречивы, что, несомненно, требует более детального изучения экспрессии микроРНК для каждого конкретного типа опухоли, что в конечном итоге будет способствовать пониманию патогенеза злокачественных новообразований, а также разработке наборов молекулярных маркеров для прогнозирования и диагностики онкологических заболеваний на основе анализа микроРНК.
Анализ ассоциации генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК с риском развития почечно-клеточных карцином
Однонуклеотидные полиморфные варианты (SNP) являются важными вариациями ДНК, создающими разнообразие среди индивидуумов и обуславливающих наличие различных фенотипов, признаков и заболеваний (Shastry, 2009). Поскольку микроРНК охватывают широкий спектр регулируемых генов, SNP в генах микроРНК и целевых сайтах могут функционировать в качестве регуляторных путем модификации воздействия микроРНК на фенотипы и предрасположенность к болезням (Ryan, Robles, Harris, 2010). Более того, SNP, расположенные в генах биогенеза и предшественников микроРНК, могут вызывать сложное воздействие, влияя на созревание микроРНК, выбор функциональной нити и определение мРНК-мишени. Присутствие SNP либо в геномных последовательностях микроРНК, либо в 3 UTR генов, связанных с развитием рака, может влиять на микроРНК-зависимую регуляцию, изменяя, следовательно, опухолевую восприимчивость (Рисунок 10) (Fabbri, Valeri, Calin, 2009).
Результаты ассоциативных исследований, посвященных изучению однонуклеотидных полиморфных вариантов в генах биогенеза микроРНК и их связи с развитием рака, широко представлены в литературе. Так, при изучении колоректального рака и рака желудка было показано, что мутации в AGO2 и TNRC6A и потеря их экспрессии являются общими для данных типов опухолей с микросателлитной нестабильностью и предполагают, что эти изменения могут способствовать развитию рака путем нарушения регулирования созревания микроРНК (Kim et al., 2010).
В настоящей работе был проведен анализ 30 полиморфных вариантов в 18 генах биогенеза и предшественников микроРНК (MIR196A2, PIWIL1, NSRP1, MIR27A, DDX5, XPO5, GPC1, FAM212B, DDX20, FAM57A, DROSHA, C5orf22, AGO2, RAN, AGO1, DICER1, GEMIN4, DGCR8).
На этапе сравнения частот аллелей и генотипов выбранных полиморфных вариантов в группах больных светлоклеточным раком почки и здоровых лиц, был проведен анализ контроля качества. В результате из исследования были исключены полиморфные варианты rs2292832 гена GPC1 и rs563002 гена DDX20, т.к. по данным полиморфным локусам отмечалось значительное отклонение в распределении частот генотипов и аллелей от равновесия Харди-Вайнберга.
В результате сравнения частот аллелей и генотипов между общей выборкой больных скПКК и контрольной группой здоровых индивидов было выявлено три полиморфных варианта генов биогенеза и предшественников микроРНК, ассоциированных с риском развития почечно-клеточных карцином (Таблица 6, Приложение В, Таблица В1). Установлено, что генотип AA (OR=0.65; CI(0.45-0.94); p=0.0221) полиморфного локуса rs1991401 гена DDX5 ассоциирован со снижением риска развития скПКК. Частота аллеля T полиморфного локуса rs595055 гена AGO1 была выше в группе больных скПКК – 74,01%, по сравнению со здоровым контролем – 67,35% (OR=1,38; CI(1,05-1,81); p=0,02). Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs1057035 гена DICER1 показал, что генотип CC и аллель C встречались в группе больных скПКК значительно чаще – 25%, чем у здоровых индивидов – 11,21% , позволяя рассматривать их в качестве маркеров повышенного риска развития скПКК (OR=2,64; CI(1.63-4.26), p=0.0006; OR=1.74 CI (1.35-2.25) p=0.0005). Частота генотипа rs1057035 TT в группе больных скПКК была ниже – 37,5%, чем в контроле – 49,56%, таким образом, у носителей данного генотипа риск развития скПКК снижен (OR=0.61; CI(0.42-0.87); p=0.0072).
После введения поправки на множественность в общей группе пациентов и контроле сохранилась ассоциация генотипов и аллелей rs1057035 гена DICER1 (pfdr=0.0002) с риском развития скПКК.
Далее был проведен анализ частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов биогенеза и предшественников микроРНК в группах больных и контроля с учетом этнической принадлежности индивидов (Приложение В, Таблица В2-В4). В результате у индивидов русской этнической принадлежности было выявлено четыре полиморфных варианта, генотипы и аллели которых ассоциированы с риском развития скПКК (Таблица 7). Так, у русских аллель rs1991401 G гена DDX5 встречался в группе больных скПКК чаще – 49,05%, чем в контрольной группе –39,11%. свидетельствуя о том, что аллель rs1991401 G может служить маркером повышенного риска развития скПКК у данной этнической группы (OR=1.49; CI(0.99-2.26) p=0.047).
Анализ частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs10773771 гена PIWIL1 показал, что аллель C и генотип CC являются маркерами пониженного риска развития скПКК (OR=0.42; CI(0.18-0.97); p=0.041 и OR=0.61; CI(0.4-0.94); p=0.024, соответственно).
Выявлена ассоциация генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1057035, расположенного в гене DICER1 с риском развития скПКК. Было обнаружено, что частота генотипа rs1057035 СС (28,57%) и аллеля rs1057035 С (49,05%) в группе больных значительно выше, чем в группе здоровых индивидов (13,86% и 36,14%, соответственно). Полученные данные указывают на то, что генотип CC и аллель C полиморфного локуса rs1057035 являются маркерами повышенного риска развития скПКК (OR=2.48; CI(1.16-5.35) p=0.016; OR=1.70; CI(1.12-2.57) p=0.011).
Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs720014 гена DGCR8 выявил значительное повышение частоты аллеля C (24,29%) в группе больных скПКК русской этнической принадлежности по сравнению с контрольной группой (14,71%). Исходя из полученных данных, аллель rs720014 C является маркером повышенного риска развития скПКК у русских (OR=1.86; CI(1.09-3.16); p=0.02).
У индивидов татарской этнической принадлежности было обнаружено два полиморфных локуса, генотипы и аллели которых ассоциированы с риском развития скПКК (Таблица 8). Было выявлено, что аллель C полиморфного локуса rs1057035 гена DICER1 является маркером повышенного риска развития светлоклеточного рака почки у татар (OR=1.61; CI(1.06-2.46); p=0.024). Частота данного аллеля у больных скПКК составила 39,38%, тогда как в контрольной группе значительно меньше – 28,66%. Также для этнической группы татар было отмечено повышение частоты генотипа TT (83,13%) и аллеля T (91,57%) полиморфного локуса rs13078 гена DICER1 в группе больных скПКК по сравнению с группой здоровых индивидов (69,81% и 83,65%, соответственно). Исходя из полученных данных, генотип rs13078 TT и аллель rs13078 T являются маркерами повышенного риска развития скПКК у татар (OR=2.13; CI(1.04-4.39); p=0.036 и OR=2.12; CI(1.09-4.15); p=0.023, соответственно).
В группе индивидов башкирской этнической принадлежности была обнаружена ассоциация генотипов и аллелей с риском развития скПКК одного полиморфного локуса – rs595055 в гене AGO1 (Таблица 9). Генотип TT встречался в группе больных скПКК с частотой 61,54%, тогда как в контрольной группе в два раза реже – 26,83%. Частота аллеля T также в группе больных была значительно выше, чем у здоровых индивидов (76,92% и 48,78%, соответственно). Было показано, что аллель rs595055 T и генотип rs595055 TT ассоциированы с повышением риска развития скПКК у башкир (OR=3.5; CI(1.83-6.75); p=0.0006). Генотип rs595055 CC, напротив, являлся маркером пониженного риска развития скПКК (OR=0.2; CI(0.04-0.77); p=0.015).
После введения поправки на множественность ассоциации генотипов и аллелей с риском развития ПКК с учетом этнической принадлежности сохранились только для полиморфного варианта rs595055 гена AGO1 у башкир (pfdr=0.001).
Анализ ассоциаций сочетаний аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК и полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК генов VHL-HIF1-зависимого пути с риском развития светлоклеточного рака почки
Анализ ассоциаций сочетаний аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК, а также полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК генов VHL-HIF1-зависимого пути, с риском развития светлоклеточного рака почки осуществлялся с помощью программы APSampler 3.6.1 (http://sourceforge.net/projects/apsampler/). Программное обеспечение APSampler, использует метод Монте-Карло Марковскими цепями и Байесовскую непараметрическую статистику, а также проводит валидацию результатов работы алгоритма на основе традиционного статистического подхода, на основе оценки значимости ассоциаций каждого найденного основным алгоритмом сочетания аллелей и генотипов с признаком по значениям точного критерия Фишера, отношения шансов (OR) и его 95%-го доверительного интервала (CI) (Судомоина и др., 2010). Значимыми считали различие сравниваемых частот при значение р-value с поправкой на множественное сравнение (FDR) менее 0,05.
При анализе полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК были выявлены сочетания аллелей, ассоциированные как с повышенным, так и с пониженным риском развития светлоклеточной почечно-клеточной карциномы. Показано, что носительство сочетания аллелей полиморфных вариантов rs6505162 C (микроРНК-423), rs2740351 A (FAM57A), rs10773771 C (PIWIL1), rs417309 A (DGCR8) снижает риск развития светлоклеточного рака почки (OR=0.18 CI(0.06-0.52); p=0.000188; pfdr=0.013) (Рисунок 11а). Напротив, обнаружено, что сочетание аллелей rs17409893 A (C5orf22), rs3809142 T (RAN), rs4968104 A (GEMIN4), rs2740348 G (GEMIN4) ассоциировано с повышением риска развития заболевания (OR=13.44 CI(3.21-56.18); p=0.000491; pfdr=0.0041) (Рисунок 11б).
Разными цветами представлены величины ORR, характеризующие взаимодействие компонентов аллельного сочетания при всех возможных комбинациях, входящих в него аллелей. Сочетание аллелей генов биогенеза и предшественников микроРНК, ассоциированное со снижением (а) и с увеличением (б) риска развития скПКК.
Полиморфный вариант rs6505162 C A находится в 12 п.н. от 3 -конца зрелой микроРНК-423–3p. Исследования связи между SNP rs6505162 и риском развития некоторых типов злокачественных новообразований демонстрируют противоречивые результаты. Так, генотипы и аллели полиморфного варианта rs6505162 ассоциированы с уменьшением риска развития рака молочной железы у женщин из Европы (Smith et al., 2012) и с увеличением риска развития рака пищевода у населения Китая (Yin et al., 2013). При изучении связи rs6505162 с риском развития колоректальной карциномы у индивидов, проживающих на территории Китая, было выявлено, что генотип AC и аллель А ассоциированы со снижение риска развития данного заболевания (Jia et al., 2018). Интересные данные были получены при изучении пролиферативной активности клеток линии HEC-1b, несущих тот или иной аллель rs6505162. Способность к пролиферации и миграции были ниже при генотипе AA по сравнению с генотипом CC в клетках HEC-1b (Su et al., 2015). При раке молочной железы клетки, трансфицированные пре-микроРНК-423-C, обладали меньшей способностью к пролиферации, чем пре-микроРНК -423-A трансфицированные клетки. При колоректальном раке было обнаружено повышение экспрессии микроРНК-423-3p, что способствовало усилению клеточного роста, тогда как экспрессия микроРНК-423-5p была снижена у пациентов по сравнению со здоровыми индивидами из контрольной группы (Li et al., 2015). Таким образом, полиморфные варианты общего предшественника микроРНК-423-3p и микроРНК-423-5p – пре-микроРНК-423, могут играть разные роли при различных стадиях развития рака.
Известно, что определенные генотипы полиморфного варианта rs2740351 в гене FAM57A могут влиять на уровень его экспрессии (Mullani et al., 2016). Также было показано, что rs2740351 ассоциирован со снижением риска развития рака яичников в аддитивной модели (Liang et al., 2010).
Поскольку глобальное нарушение зрелых микроРНК становится общей чертой опухолей человека (Melo et al., 2010), и, учитывая критические функции продуктов генов DROSHA, DGCR8, Exportin-5 (XPO5), RAN и DICER в биогенезе микроРНК, логично предположить, что полиморфные варианты в этих генах могут влиять на процессинг микроРНК и, следовательно, на риск развития рака. Несколько исследований показали значительную связь между однонуклеотидными полиморфными вариантами генов биогенеза микроРНК с риском развития различных типов злокачественных новообразований. Продукты генов DROSHA и его основного кофактора DGCR8 являются критическими белками, которые выполняют начальный этап в процессинге микроРНК (Lee et al., 2003). Нарушение регуляции DROSHA и DGCR8 наблюдается при многих видах рака, таких как эпителиальный рак кожи (Sand et al., 2010), рак молочной железы (Chen et al., 2013) и рак яичников (Guo et al., 2015). Мета-анализ, проведенный группой авторов из Китая, выявил, что генотип GG rs417309 в гене DGCR8 встречается значительно реже среди пациентов с онкологическими заболеваниями по сравнению с индивидами из контрольной группы, а генотип TT rs1057035 в DICER1 был связан с увеличением риска развития злокачественных новообразований на 13% (He et al., 2016). Также, отмечается что аллель А rs417309 ассоциирован с повышением риска развития онкологических заболеваний. Согласно современным данным, полиморфный вариант rs417309 расположен в сайте связывания с микроРНК-106b и микроРНК-579 в области 3 -UTR гена DGCR8. Предполагается, что наличие рискового аллеля А rs417309 может способствовать повышению экспрессии DGCR8, вероятно, путем нарушения связывания с микроРНК, способствуя, таким образом, развитию опухоли (Wen et al., 2018).
Ген GEMIN4, расположенный в области 17q13, кодирует одноименный белок, который является частью комплекса RISC. Недавние исследования показали, что полиморфные варианты в гене GEMIN4 связаны с этиологией и клиническим исходом различных типов онкологических заболеваний, таких как рак мочевого пузыря (Yang et al., 2008), рак почки (Horikawa et al., 2008; Lin et al., 2010) и рак яичников (Liang et al ., 2010). При изучении рака предстательной железы, было показано, что аллели дикого типа rs49468104 T и rs274034 T гена GEMIN4 ассоциированы со снижением риска развития заболевания (Liu et al., 2012). Согласно выделенной нами модели, сочетания аллелей полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК, аллели rs49468104 A и rs274034 G гена GEMIN4с были ассоциированы с повышением риска развития скПКК. Мета-анализ, проведенный Zhu с соавторами, также выявил повышение риска развития злокачественных новообразований у носителей генотипа GG полиморфного варианта rs2740348 гена GEMIN4 (Zhu et al., 2016).
Таким образом, проведенный анализ ассоциаций сочетаний аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК позволил установить взаимосвязь между полиморфными вариантами изученных генов с риском развития светлоклеточной почечно-клеточной карциномы и оценить вклад исследованных полиморфных локусов в развитие скПКК. Наличие множества взаимосвязей между генами оказывает совокупное действие на развитие рака почки, что свидетельствует о необходимости их учета при прогнозировании заболевания.