Введение к работе
Актуальность теми. Нарушения развития и функции органов репродуктивной системы у человека занимают третье место среди всех врожденных пороков развития (Курило, 1996; Barakat et al., 1986). В среднем, у 10% пациентов с нарушением репродуктивной системы выявляются аномалии хромосом. Известно, что 70-75% хроиосомопатнй, сопровождающихся аномаггаямн репродуктивной функции, возникают в результате численных или структурных нарушений половых хромосом (Курило, 1996; 1997; 1998; Yoshida et al., 1997). В большинстве случаев эти аномалии связаны с синдромом Клайнфельтера - 6-7% случаев; со структурными перестройками хромосом X н Y или с мозанцязмом по нарушениям гоносом - 1-3% (Курило, 1996; 1998; van Assche et al., 1996). Цитогенетические исследования лимфоцитов периферической крови, как правило, позволяют установить характер большинства хромосомных нарушений. Однако, при использовании традиционных цитогенетнческих методов остается нерешенным ряд проблем, связанных с диагностикой сложных форм хромосомной патологии (Ворсанова, 1991; Соловьев н др., 1995; Vorsanova et al., 1997). Вместе с тем, эффективная и своевременная цнтогенетическая диагностика делает возможным разработать тактику определенной гормональной коррекции здоровья пациентов с нарушением полового развития до наступления пубертатного периода.
В последние годы определены принципиально новые подходы к идентификации аномалий кариотина на основе гибридизации клонированных последовательностей ДНК человека - хромосомоспецифичных ДНК-зондов в условиях in situ. Так называемый иолекулярно-цитогенетнческий метод или метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ позволяет использовать не только метафазные, но и ннтерфазные клетки, что ставит его в ряд наиболее доступных н высоконпформатнвных (Ворсанова, 1991; Ворсанова и др., 1989; 1991; 1998; Соловьев и др., 1995; Holmes, Martin, 1993; Martin et al., 1993; Guttenbach et al.. 1994; 1997; Vorsanova et al., 1986; Soloviev et al, 1995; 1997; Yurov et al., 1996). Молекулярно-цитогенетнческне методы могут успешно применяться для диагностики таких хромосомных нарушений, как добавочные (маркерные, мннн-) хромосомы, часто являющиеся дериватами половых хромосом; сложные случаи гоносомного мозанцизма; участие в хромосомных перестройках более 3-х хромосом; гипо- и гипергаплондня в половых клетках (Ворсанова, 1991; Ворсанова и др., 1989; 1998; Соловьев и др., 1995; Курило, 1996; Cremer et а]., 1986; Vorsanova et al., 1986; Guttenbach et al., 1994; 1997; Yurov et al., 1996). Эффективная диагностика с помощью молекулярной гибридизации в условиях in situ способствует успешпому, своевременному обнаружению сложных хромосомных нарушений, как в соматических, так и в половых клетках.
Гибридизация in situ позволяет выявлять н анализировать нормальные или аномальные хромосомные ДНК-последовательности на всех стадиях клеточного цикла, что делает возможным определение числа хромосом в ядрах сперматозоидов человека со сверхкондеисированной ДНК, а также в интерфазных клетках лимфоцитов периферической крови, значительно ускоряя диагностику н повышая ее эффективность (Ворсанова и др., 1991; Goldman et al., 1993; Miharu et al., 1994; Martin et al., 1995; Rousseaux, Chevret, 1995; Soloviev et al., 1995; Hummelen et al., 1996; Yurov et al., 1996). Применение интерфазной молекулярно-цнтогенетической диагностики обеспечивает возможность выявления и анализа анеуплонднй хромосом в некультивированных клетках, что особенно важно для эффективного определения численных хромосомных аномалий в половых клетках.
Исследования хромосомных аберраций в половых клетках пациентов с нарушением репродуктивной функции с помощью молекулярно-цитогенетнческнх методов до настоящего времени не получили достаточно широкого применения. Не оценена частота хромосомных аномалии в незрелых половьк клетках эякулята, как в норме, так и при нарушении репродуктивной системы. Вместе с тем эффективнее определение доли и типов хромосомной патологии на разных стадиях гаметогенеза, изучение механизмов селекции гамет, выявление причин бесплодия важно для своевременной соответствующей лечебной коррекции пациентов с аномалиями полового развития и нарушениями репродуктивной функции, а также проведення генетического консультирования в семье.
Следует отметить, что мужские половые клетки более доступны для исследования, чем женские. Получение большого числа половых клеток из эякулята делает возможным проведение экспериментов по гибридизации in situ, и анализ полученных результатов не является трудоемкой и длительной процедурой, что обеспечивает высокую эффективность диагностики, ее информативность.
Однако, до настоящего времени, не разработаны показания для применения молекулярно-цитогенетнческнх методов в диагностике аномалий полового развития и/или нарушений репродуктивной функции, связанных с хромосомными аберрациями у пациентов мужского пола.
Все вышесказанное свидетельствует о необходимости изучения аномалий гоиосом с различными формами нарушения репродуктивной системы, а также определения показаний к проведенню молекулярно-цитогенетнческнх исследований половых и соматических клеток у лиц мужского пола с нарушением репродуктивной функции и/нли аномалиями полового развития.
В связи с этим, была поставлена цель и задачи данного исследования.
Цель: На основе молекулярно-цнтогенетического исследования установить удельный вес и тип аномалий гопосом у взрослых пациентов и у детей мужского пола с различными формами нарушения репродуктивной системи
Для осуществления целн были поставлены следующие задачи:
-
Определить удельный вес и тип хромосомных аномалий среди детей и взрослых пациентов мужского пола с нарушением репродуктивной системы, используя методы цитогенетичесКого аиалща.
-
Провесні молекулярно - цигоіенспіческне исследования у пациентов с нарушенном репродуктивной системы для выявления сложных случаев гоносомного мозаицизма или псевдомозанцизма при небольшой доле аномального клона, определения происхождения маркерных гоиосом, уточнення точек разрыва при структурных хромосомных аберрациях.
-
Оптимизировать условия проведения молекулярно-цитогенетнческнх исследований - изотопной и флюоресцентной гибридизации нуклеиновых кислот in situ (OSH и FISH) для изучения хромосомных аберраций в половых клетках.
-
Определить частоту анеуплоиднй гоносом и некоторых аутосом в половых клетках эякулята пациентов с нарушением репродуктивной системы и в норме.
-
Разработать показания к применению молекулярно-цнтогенетической диагностики при нарушении репродуктивной системы у индивидуумов мужского пола
Научная новизна. Впервые оценена диагностическая значимость молекулярно-цнтогенетических методов при определении уровня аномалий гоносом в половых и соматических клетках в норме и при патологии репродуктивной системы у индивидуумов мужского пола.
Впервые определен удельный вес и тип анеуплоидий гоносом, а также некоторых аутосом в незрелых половьи клетках эякулята у пациентов с азооспермией или тяжелой формой олигозооспермнн.
Впервые, на основе применения молекулярно-цитогенетических методов
(двухцветовая FISH), разработана схема идентификации маркерных хромосом у детей н взрослых пациентов с аномалиями репродуктивной системы.
Впервые определена корреляция между хромосомными аномалиями в соматических н половых клетках.
Впервые, на основе применения молекулярно-цитогенетических методов, определен уровень нерасхождения хромосом в половых клетках у пациентов с синдромом Клайнфельтера.
Научно-практическое значаще работы.
_ Разработаны показания для проведення молекулярно-цитогенетнческой диагностики три нарушении репродуктивной системы у лиц мужского пола (дети и половозрелые іацнентьі). Рекомендована схема определения происхождения маркерных хромосом у іацнентов с нарушением репродуктивной системы. Подтверждена эффективность применения методов интерфазноб молекулярной цитогенетики для выявления фомосомных анеуплоидий в соматических н половых клетках человека
Положения, выдвигаемые на защиту.
1. Среди пациентов фенотипнческн мужского пола обнаружена частота аномалий
оносом: у детей с задержкой полового развития - 14,894, у мужчин с нарушением
^продуктивной функции- в 13,5% случаев.
-
Показаниями для молекулярно-цитогенетического исследования при аномалиях юлового развития и нарушении репродуктивной системы являются: наличие в арнотипе дополнительной маркерной хромосомы, мозаицизм с присутствием двух или іолее клеточных линий, терминальные или ннтерстнциальные делецни и инверсии, гтергая клиническая картина синдрома (forme fruste), обнаружение нарушений аметогенеза (азооспермия, олигозооспермия, тератозооспермия) при анализе клеток якулята
-
Около 40% случаев аномалий гоносом, выявленных методами классической [итогеиетики, требуют молекулярно-цитогенетических исследований с целью уточнения ілн установлення диагноза.
4. Молекулярно-цитогенетические исследования эякулята выявляют повышенный
дельный вес хромосомных анеуплоидий (как аутосом, так н гоносом) в половых клетках
іациентов с нарушением репродуктивной функции.
Апробация работы. Материалы работы доложены на: 1-й Балканской конференции енетнков человека (Афины, Греция, 1994); Международной конференции "Актуальные роблемы профилактики неинфекциониых заболеваний" (г.Москва, Россия, 1995); 1-м оигрессе PECO-EUCROMIC (Прага, Чехия, 1996); конференции Европейского общества
медицинских генетиков (Лондон, Великобритания, 1996); конференциях "Геном человека"-96; -97; -98 (г.Черноголовка Московская обл., Россия); Российской конференции по проблемам медико-генетнческого консультирования (Москва, Россия, 1997); 2-м конгрессе PECO-EUCROMIC (Будапешт, Венгрия, 1997); дважды на совместном заседании отделов молекулярной цитогенетики Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, цитогенетики НЦПЗ РАМН, лаборатории генетики нарушений репродукции МГНЦ РАМН и кафедры генетики Российской медицинской академии последипломного образования (Москва, Россия, 1997).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 печатные работы, нз них 12 в отечественной н 21 в зарубежной печати.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ... страницах машинописного текста и состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материал н методы исследования", 'Тезультаты и обсуждение собственных исследований", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы", включающий 49 отечественные работы и 205 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 15 рисунками.