Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение организации и эволюции генома является одной из актуальных задач генетики. Развитие флуоресцентной in situ гибридизации, сортинга хромосом и DOP-ПЦР привело к разработке метода сравнительного хромосомного пэйнтинга, который основан на использовании наборов индивидуальных библиотек сортированных хромосом (пэйнтинг-проб) для гетерологичной флуоресцентной гибридизации. Новый подход в сочетании с методами классической цитогенетики оказался эффективным для быстрого и точного анализа консервативных сегментов в кариотинах практически любых видов позвоночных. К настоящему времени с помощью хромосемнош пэйнтинга уже изучены геномы около 150 видов млекопитающих (Графодатский, 2007).
Анализ данных сравнительного хромосомного гайнтиша показал, что существуют консервативные районы хромосом, которые, несмотря на миллионы лет дивергенции, сохраняют высокий уровень гомологии в геномах различных видов. Выявление таких консервативных сегментов в кариотипах кик близкородственных, так и отдаленных видов позволяет определять хромосомные перестройки, разделяющие кариотипы изучаемых групп животных. При налички достаточного числа вовлеченных в исследование видов можно реконструировать предполагаемый кариотип предка и возможный сценарий кариотипической эволюции таксона. На данный момент определены вероятные структуры предковых кариотинов основных групп отрядов класса млекопитающих (например, Afrotheria (Yang et al., 2003, Froenicke et al., 2003), Xenarthra (Yang et al., 2006), Laurasiatheria (Yang et al., 2006, Balmus et al.. 2007), Primates (Stanyon et al., 2008).
Известно, что филогенетические отношения внутри многих отрядов (например, Rodentia, Perissodactyla, Cctartiodactyla (Cetacea+Artiodactyla)) до сих пор остаются спорными. Было показано, что хромосомные перестройки могут служить надежными филогенетическими маркерами дивергенции млекопитающих (O'Brien et al., і 999), и в настоящее время разработан подход к использованию перестроек хромосом как характеристик определенных таксонов при построении филогенетических деревьев (Dobigny et al., 2004).
Настоящая работа посвящена изучению филогенетических взаимоотношений внутри отрядов Perissodactyla (непарнокопытные) и Cetartiodactyla (китопарнокопытные) с помощью метода сравнительного хромосомного пэйнтинга.
Отряд непарнокопытных представляет существенный интерес для исследования закономерностей хромосомной эволюции, так как объединяет виды, обладающие значительными вариациями диплоидных чисел хромосом (от 32 у горной зебры до 84 у черного носорога). Постоянное внимание привлекает возможность получения жизнеспособных межвидовых гибридов между некоторыми представителями отряда и высокие темпы преобразования хромосомных наборов лошадиных в ходе эволюции.
В то же время информации о формировании кариотипов современных представителей непарнокопытных недостаточно. На данный момент только для
семейства лошадиных проведены тщательные исследования гомологии хромосом между несколькими видами и определены сегменты гомологии с хромосомами человека. Для таксона носороговых опубликована одна работа по сравнительному пэйнтингу, где кариотипы белого и чёрного носорога сопоставлены с кариотипом бурчелловой зебры; семейство тапировых до настоящего времени вообще не было изучено.
Отряд парнокопытных включает виды, удивительно разнообразные по морфологическим признакам (от самого большого млекопитающего планеты -голубого кита до крошечного оленька, живущего в тропическом подлеске). Диплоидные числа хромосом в кариотипах варьируют от 6 у мунтжака до 74 у верблюдов. Основной акцент в исследовании отряда был сделан на построении сравнительных цитогенетических карт высокого уровня разрешения и секвенировании геномов таких важных представителей этого таксона, как корова и свинья. Несмотря на то, что отряд парнокопытных всегда был объектом интереса многих групп ученых, часть ключевых семейств (например, Hippopotamidae, Cetacea, Giraffidae) слабо или совсем не исследованы с помощью методов молекулярной цитогенетики. В работе Балмуса с соавт. (Balmus et а/., 2007) приведен возможный предковый кариотип парнокопытных, который нуждается в дальнейшем подтверждении или корректировке, поскольку был реконструирован по результатам исследования только части семейств этого отряда.
Пели и задачи работы.
Целью настоящей работы является выявление закономерностей и особенностей эволюции кариотипов млекопитающих из отрядов Perissodaetyla (непарнокопытные) и Cetartiodactyla (китопарнокопытные).
Для составления картины кариотипических эволюционных изменений в отрядах были поставлены следующие задачи:
-
Охарактеризовать кариотипы представителей отряда непарнокопытных с помощью пэйнтинг-проб человека, чепрачного тапира и зебры Грэви.
-
Охарактеризовать кариотипы представителей отряда китопарнокопытных с помощью пэйнтинг-проб человека и одногорбого верблюда.
-
Проанализировать данные сравнительного хромосомного пэйнтинга, реконструировать предковые кариотипы непарнокопытных и кигопарнокопытных.
-
Проследить возможный ход перестроек, приведших к формированию кариотипов видов из отрядов непарнокопытных и китопарнокопытных. Оценить темпы преобразований кариотипов в различных таксонах этих отрядов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые в эксперименты по сравнительному хромосомному пэйнтингу вовлечены следующие виды: чепрачный тапир (Tapirus indicus), зебра Грэви (Equus grevyi), онагр (Equus hemionus onager), обыкновенная гринда (Globicephala melas), обыкновенный бегемот (Hippopotamus amphibius), окапи (Okapia johnstoni), саола (Pseudoryx nghetinhensis) и сибирская кабарга (Moschus moschiferus).
Впервые охарактеризованы и использованы для определения сегментов гомологии между кариотипами представителей отряда непарнокопытных
хромосомоспецифичпые библиотеки чепрачного тапира и зебры Грэви. Для исследования кариотигшческой эволюции в отряде китопарнокопытных были использованы в качестве зондов хромосомы одногорбого верблюда. В качестве внешней группы для всех изученных видов животных был выбран консервативный кариотип человека (Homo sapiens), что позволило прокести детальный анализ кариотипических преобразований, свойственных представителям таксонов непарнокопытных и китопарнокопытных.
Обработка данных сравнительного хромосомного пэйнтинга с помощью пакета программ PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) позволила получить первое филогенетическое древо непарнокопытных, построенное на основе перестроек хромосом. Тщательный анализ результатов помог уточнить структуры предковых кариотипов непарнокопытных и китопарнокопытных, а также реконструировать предковые кариотипы всех групп внутри этих отрядов.
В целом но результатам проделанной работы удалось проследить изменения хромосом, сопровождавшие эволюцию отрядов, оценить скорости кариотипических преобразований в различных ветвях филогенетического древа непарнокопытных и китопарнокопытных. Впервые показана огромная вариабельность скоростей эволюции кариотипов внутри таксона непарнокопытных.
Использование хромосомного набора человека, как вида, геном которою детально картирован, придает особую практическую ценность данной работе: создает базу для картирования геномов видов непарнокопытных и китопарнокопытных.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на Международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы», Новосибирск, 2005 г.; XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург, 2005 г., конференции «Биоразнообразие и динамика генофондов», Москва, ФИАН, 2007 г.; V конференции молодых ученых СО РАН, посвященной М.А. Лаврентьеву, Новосибирск, 2007 г., конференции «Хромосома 2009», Новосибирск, 2009г.
Публикации. По результатам работы опубликовано три статьи.
Вклад автора. Автором выполнены работы по культивированию используемых в исследовании первичных линий фибробластов и получению суспензий хромосом большей части животных, вовлеченных в исследование. Проведено дифференциальное окрашивание кариотипов всех исследованных видов, все эксперименты по гибридизации in situ, анализ результатов локализации пэйнтииг-проб и идентификация хромосом.
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащие 219 ссылок, и 1 приложения. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 35 рисунков.