Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на то, что крупный рогатый скот является ведущим видом-продуцентом молока, молекулярные механизмы регуляции экспрессии казеиновых генов крупного рогатого скота остаются малоизученными. Только 5'-фланкирующий район гена Р-казеина исследован достаточно детально (Schmidhausen et al.,1990; Schmidhausen et al., 1992; Myers et al., 1998). Некоторые фланкирующие районы генов aSl- (Platenberg et al., 1996), aS2- (Groenen, 1992) и к-казеина (Adachi et al., 1996) клонированы и секвенированы, но их вклад в изменение уровня экспрессии казеиновых генов в настоящее время не оценен.
Принимая во внимание высокий уровень эволюционного консерватизма геномов крупного рогатого скота, человека и домовой мыши (httpV/), данные полного секвенирования геномов двух последних видов могут быть использованы для выявления участков эволюционного консерватизма в пределах 5'-фланкирующих областей кластера казеиновых генов крупного рогатого скота.
Регуляция экспрессии большинства генов осуществляется преимущественно на уровне транскрипции. Регуляция имеет комплексный характер, в ней принимает участие целый ряд регуляторних последовательностей - промоторы, энхансеры, MAR/SAR (matrix/scaffold attaching regions), инсуляторы, LCR (locus control regions). Наибольший интерес вызывают последние, способные поддерживать высокий уровень экспрессии трансгена независимо от точки интеграции (Li, 2002; Mullins Mullins, 2004). Гены белков молока в силу своих биологических особенностей представляют собой удачную модель для изучения тканеспецифической и стадиеспецифической экспрессии. Эпителиальные клетки молочной железы специализированы для синтеза ограниченного числа белков в периоды беременности и лактации. Уровень транскрипции этих белков очень высок, например, матричная РНК генов казеинов
составляет до 80 % общего содержания мРНК в клетке (Hobbs at al., 1982). Варьирование уровня экспрессии от 0 до 80 % свидетельствует о значительном влиянии регуляторных элементов на экспрессию генов казеинов. По этой причине регуляторные элементы кластера казеиновых генов могут найти свое применение для создания векторов, обеспечивающих эффективный синтез белковых продуктов биофармацевтического назначения. Кроме того, данные о регуляторных районах могут быть использованы в практическом животноводстве для селекции с помощью молекулярных маркеров (marker assisted selection, MAS) (Tankey, 1993; Georges et al., 1995; Phillips, 1999).
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является выявление новых регуляторных последовательностей кластера казеиновых генов.
Поставлены следующие задачи:
-— выявление районов эволюционного консерватизма 5'-фланкирующей области кластера казеиновых генов млекопитающих на глубину до 15 т.п.н. от стартового кодона гена CSN1S1
— клонирование кластера казеиновых генов крупного рогатого скота в
форме контига протяженных геномных клонов
— выявление полиморфных вариантов эволюционно-консервативных
районов кластера казеиновых генов крупного рогатого скота методом SSCP
— выявление SNP путем прямого секвенирования эволюционно-
консервативных районов кластера казеиновых генов крупного рогатого скота
— анализ сайтов связывания транскрипционных факторов включающих
выявленные SNP
— сравнение частот аллелей SNP эволюционно-консервативных районов
кластера казеиновых генов у крупного рогатого скота мясного и молочного направлений
Научная новизна работы. Путем анализа нуклеотидных последовательностей in silico выявлено 10 районов эволюционного консерватизма 5'-фланкирующей области кластера казеиновых генов млекопитающих. Клонирован кластер казеиновых генов крупного рогатого скота в форме контига шести протяженных геномных клонов. Методом SSCP выявлено семь полиморфных вариантов эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов крупного рогатого скота. Выявлено пять новых SNP в пределах эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов крупного рогатого скота путем прямого секвенирования. Четыре сайта связывания транскрипционных факторов, включающих выявленные SNP, обнаружены в пределах эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов. По частотам аллелей двух SNP у крупного рогатого скота мясного и молочного направлений обнаружены достоверные различия, что свидетельствует о возможной связи этих маркеров с признаками молочной продуктивности.
Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты представленной к защите работы использованы при составлении баз данных по генетическим и физическим картам хромосом крупного рогатого скота и сравнительным картам человека, мыши и крупного рогатого скота () и банка данных нуклеотидных последовательностей () в сети Интернет. Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре естествознания Ленинградского государственного университета в рамках курсов «Генетика с основами селекции» и «Молекулярная биология».
Апробация работы. Материалы работы бьши представлены на международной конференции «Современные методы в генетике и селекции животных» (Санкт-Петербург, 2007), XVI международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2008), конференции "Ориентированные фундаментальные исследования и их
реализация в АПК России" (Санкт-Петербург, 2008), на второй
международной научно-практической конференции "Проблемы биологии,
экологии, географии, образования: история и современность" (Санкт-
Петербург, 2008), на XIII царскосельских чтениях «Высшая школа —
инновационному развитию России» (Санкт-Петербург, 2009). Результаты
периодически докладывались на семинарах лаборатории молекулярной
организации генома ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН. Исследования проводили в
соответствии с планом научно-исследовательской работы ГНУ ВНИИГРЖ
РАСХН по теме «Разработать систему молекулярно-генетических маркеров,
обеспечивающих повышение эффективности селекции
сельскохозяйственных животных» (номер государственной регистрации 01.200.118843).
Публикация результатов. Материалы, представленные в диссертации были опубликованы в научных журналах "Цитология" и "Сельскохозяйственная биология". Всего по теме работы опубликовано 9 печатных работ, из них 2 статьи и 7 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц, 4 рисунка и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Практические предложения» и «Список литературы». Список цитированной литературы насчитывает 134 названия, 122 работы - на английском языке, 10 - на русском, 1 - на французском, 1 - на немецком.
