Введение к работе
Актуальность проблемы. Стрессорная реакция - это естественная биологическая защита организмов от неблагоприятных воздействий внешней среды. Резко изменяя гормональный статус и энергетический метаболизм при столкновении с неблагоприятными факторами среды, стрессорная реакция способствует адаптации организмов и тем самым защищает их от этих воздействий.
Стрессорная реакция была впервые обнаружена Гансом Селье (Selye, 1956) у млекопитающих, а впоследствии открыта и у насекомых (см. обзоры: Ivanovic, 1988; Cymborovski, 1988; Rauschenbach, 1988). Эта реакция универсальна и возникает в ответ на самые разнообразные стимулы, непривычные для жизни и обитания не только данного вида организмов, но и отдельной популяции. Она настолько древняя и эволюционно консервативна, что развивается у организмов, пути эволюции которых разошлись многие миллионы лет назад.
У насекомых центральными звеньями этой реакции являются ювенилъныи гормон, играющий важную роль в регуляции развития насекомых, и биогенные амины, контролирующие нейромышечную активность и энергетический метаболизм (обзоры: Раушенбах, 1990; Cymborovski, 1988; 1991; Раушенбах, Шумная, 1993).
У личинок насекомых механизм стрессорной реакции изучен детально. Показано, что именно повышение содержания ювенильного гормона при стрессе вызывает состояние диапаузы или задержку метаморфоза у недиапаузирующих насекомых, позволяя им таким образом переждать неблагоприятные условия (Раушенбах, Лукашина, 1984; Rauschenbach et al., 1987; Раушенбах, 1990; Cymborovski, 1988; 1991). Причем, в реализации этого ответа главную роль играет система деградации ювенильного гормона (Bogus, Cymborowski, 1984; Mala et al, 1987; Rauschenbach et al, 1987; 1991; Bogus, Scheller, 1988; Cymborowski, 1988,1991).
Что касается механизмов стресс-реакции у имаго насекомых, то они изучены слабо. Крайне мало известно о роли ЮГ в стресс-реакции имаго. Основные усилия исследователей направлены на изучение биогенных аминов и многочисленные исследования свидетельствуют, что первой реакцией биогенных аминов на стрессорное воздействие у разных видов насекомых является повышение их уровня в гемолимфе и в тканях нейрального происхождения. Эта реакция возникает при действии самых разнообразных стрессоров (Orchard, Lounghton, 1981; Davenport, Evans, 1984a,b; Evans, 1985; Kozanek et al, 1986; 1988; Harris, Woodring 1992; Hirashima et al, 1992; 1993a,b; Hirashima, Eto, 1993 a,b,c: Rauschenbach et al, 1993). Однако, какие звенья в цепи метаболизма дофамина и октопамина ответственны за повышение их уровня при стрессе и каков их генетический контроль, до сих пор неизвестно.
Что касается исследований генетических механизмов регуляции стрессорной реакции, то они немногочисленны и связано это, с одной стороны, со сложностью протекания этой реакции у млекопитающих, а с другой - с отсутствием адекватной экспериментальной модели, пригодной для такого рода исследований. Для изучения генетики стресса предпочтительнее организмы с простой нейроэндокринной регуляцией, достаточно полно изученные в генетическом плане.
'' Такая модель была создана на основе двух линий Drosophila virilis, контрастных по реакции на стрессорное воздействие. Суть ее в том, что у личинок одной из этих линий (101), в неблагоприятных условиях среды развивается стрессорная реакция, которая позволяет им адаптироваться и нормально метаморфизировать, а у особей другой линии (147) подобная реакция отсутствует и они не способны к метамофозу при 32СС (Раушенбах и др., 1977; обзор: Раушенбах, 1990). Эта модель оказалась исключительно плодотворной и позволила нам провести целый ряд исследований по выяснению механизмов реализации стрессорного ответа у имаго Drosophila, как на уровне целого организма, так и на уровне клетки.
Таким образом, актуальность данного исследования обусловлена тремя не решенными до сих пор проблемами: 1) участвует ли система деградации ювенального гормона, играющая центральную роль в стресс-ответе у личинок Drosophila, в реализации стрессорной реакции у имаго Drosophila; 2) каков механизм контроля ответа биогенных аминов на стресс у насекомых и 3) каковы взаимоотношения между двумя важнейшими защитными реакциями - нейрогормональной стрессорной реакцией организма и "хит-шок" ответом клетки.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в комплексном исследовании основных звеньев стрессорной реакции у имаго Drosophila на уровне организма и клетки для выявления и изучения генных систем, участвующих в ее контроле.
Сформулированная цель и предлагаемый экспериментальный подход в виде модели, состоящей из двух, контрастных по реакции на стресс линий (101 и 147) D. virilis, подразумевали решение следующих конкретных задач:
-
Исследовать два важнейших звена стрессорной реакции у насекомых - систему деградации ювенильного гормона и систему метаболизма дофамина и октопамина у имаго Drosophila.
-
Изучить реакцию отдельных компонентов этих систем на стрессорное воздействие у имаго линий D. virilis, контрастных по реакции на тепловое воздействие.
-
Выявить те звенья в цепи метаболизма дофамина и октопамина, которые участвуют в реализации стрессорного
ответа и изучить динамику их изменений в условиях стресса различной длительности.
-
Провести генетический анализ выявленных межлинейных различий и локализовать гены, контролирующие их.
-
Для выяснения механизмов взаимоотношений между стрессорным ответом на уровне организма и на уровне клетки исследовать внутриклеточный стресс-ответ у контрастных по реакции на стресс линий D. virilis.
Научная новизна результатов исследования. Впервые проведено комплексное исследование основных звеньев стрессорной реакции у имаго Drosophila на уровне организма и клетки. Это позволило показать, что у имаго Drosophila в реализации стрессорного ответа участвуют система деградации ювенального гормона, которая у разных видов Drosophila обеспечивается разными ферментными системами, и система синтеза биогенных аминов.
Впервые показано, что система деградации ЮГ контролирует откладку яиц самками и участвует в реализации стрессорного ответа только у самок Drosophila. Это позволило сформулировать представление о ее роли в регуляции репродуктивной функции самок и отсутствия таковой у самцов.
На основании изучения динамики развития реакции системы биогенных аминов на стресс впервые было сделано заключение о наличии разных механизмов, контролирующих уровень аминов при стрессе. Если в начале реализации стрессорного ответа эти механизмы связаны, по-видимому, с регуляцией выброса аминов из депо и инактивацией системы их депонирования, то последующее поддержание их высокого уровня при стрессе осуществлялось через прямой контроль активности ферментов, синтезирующих их.
Наличие экспериментальной модели, представленной двумя линиями Drosophila virilis, одна из которых не способна к развитию стрессорной реакции, позволило впервые изучить генетический контроль тех звеньев в цепи метаболизма ювенилыюго гормона и биогенных аминов, которые участвуют в реализации стрессорного ответа. Эти данные позволили прийти к заключению, что изученные звенья стресс-реакции находятся под контролем одного гена и сформулировать представление о существовании единого генетического контроля различных звеньев нейрогормональной стрессорной реакции у Drosophila. Предложена гипотеза о природе гена, осуществляющего этот контроль.
На основании изучения взаимоотношений между стрессорной реакцией организма и клетки впервые получены свидетельства того, что эти две важнейшие защитные реакции контролируются у Drosophila через различные сигнальные системы.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты работы дают качественно новую информацию о механизмах реализации стрессорного ответа у имаго Drosophila. Наличие одинаковых звеньев в системе реализации стресс-ответа у самых разных организмов позволяет предполагать, что некоторые из выявленных закономерностей контроля стрессорнои реакции как на уровне клетки, так и на уровне целого организма могут носить более общий характер и быть присущи не только Drosophila. Возможность экстраполяции значительно повышает ценность полученных результатов и делает их полезными для всех исследователей, занимающихся проблемой стресса.
Изучение и сопоставление механизмов реализации стрессорного ответа у разных оргаюїзмов, в том числе и у насекомых, расширяет наше представление о функционировании этой защитной реакции и могли бы пролить свет на эволюционные закономерности ее возникновения.
Факт доказанного участия тирозиндекарбоксилазы в реализации стрессорнои реакции у Drosophila и простота оценки ее уровня активности позволяет использовать ее в качестве теста для определения стресс-устойчивости, по крайней мере у Diptera (Грунтенко и др., 1997).
Предложен экспериментальный подход для выяснения взаимотношений между гормональной стрессорнои реакцией и "хит-шок" ответом клетки, который используется для выяснения взаимоотношений между другими звеньями стрессорнои реакции и изучения путей ее реализации (Gruntenko et al., 2000).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VI международной конференции по ювенильному гормону (Вудс Холл, США, 1995), международной конференции "Агробиология и биотехнология растений и животных" (Киев, 1997), международной конференции "Современные концепции эволюционной генетики" (Новосибирск, 1997), международной конференции "Адаптация организма к природным и экосоциальным условиям среды" (Бишкек, 1998), XVIII Международном генетическом конгрессе (Пекин, Китай, 1998), международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры животных" (Киев, 1999), международной конференции "Генетическая и онтогенетическая психонейроэндокринология" (Новосибирск, 1999), I и II съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994; Санкт-Петербург, 2000), а также на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в 1991, 1994,1997 и 2000 гг.
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 39 работах в отечественных и зарубежных изданиях.
Объем и структура работы. Работа изложена на 342 страницах и состоит из введения, трех глав обзора литературы, описания использованных методов, трех глав экспериментальных результатов, четырех глав обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 841 наименование. Работа иллюстрирована 44 таблицами и 42 рисунками.