Введение к работе
Поиск последовательностей ДНК, ортологичных последовательностям из эволюционно-удаленных организмов позволяет находить ранее неизвестные гены в геноме человека Особый интерес представляют гены, продукты которых выполняют уже известные функции у других организмов, но их ортологи у человека пока не известны Поэтому высоко актуальными являются исследования, направленные на поиск и изучение ортологов в геноме человека, для генов функционально охарактеризованных в других организмах
Семейство генов, кодирующих белки щелевых межклеточных контактов (иннексинов) хорошо охарактеризовано у беспозвоночных. Считалось, что эти гены у позвоночных отсутствуют, а их функция замещена генами, кодирующими коннексины Однако полное исчезновение генов гомологичных иннексинам представлялось маловероятным Данная работа посвящена характеристике паннексинов - генов позвоночных, гомологичных генам щелевых межклеточных контактов беспозвоночных
Цель и задачи исследования. Целью исследования является поиск генов человека, ортологичных генам иннексинов, кодирующих белки щелевых контактов беспозвоночных, а также характеристика этих генов и их продуктов у позвоночных, включая человека
Для реализации поставленной цели при исследовании генов решались следующие задачи:
А. Провести сравнительный биоинформатический анализ генов и белков позвоночных и беспозвоночных, для поиска и характеристики генов-ортологов иннексинов, в том числе:
1 Провести биоинформатический поиск генов в геноме человека и мыши, гомологичных гену паинексина PANXI.
2. Установить экзон-интронную структуру найденных генов-ортологов (паннексинов) в геноме человека и мыши.
ЮС НАЦИОНАЛЬНАЯ \ КИМИ0ТЕКА І
3 Провести биоинформатический анализ предсказанных аминокислотных
последовательностей, кодируемых паннексинами, с целью выявления доменов с
функциями, ранее установленными для других белков
Б. Провести экспериментальный анализ генов кодирующих паннексины и их продуктов, в том числе
-
Выявить и охарактеризовать изоформы мРНК паннексинов в геноме человека и мыши
-
Определить спектр тканеспецифичности экспрессии найденных генов паннексинов человека
-
Определить тканевую локализацию транскриптов, кодируемых генами паннексинов в клетках хрусталика глаза и эмбриона мыши
Научная новизна.
Описаны два ранее неизвестных гена человека PANX2 и PANX3, относящиеся вместе с ранее найденным геном человека PANX1 к одному семейству (паннексины), ортологичному семейству генов, кодирующих белки щелевых контактов беспозвоночных (иннексины) В геноме мыши описаны ортологи генов, кодирующих паннексины человека Впервые охарактеризованы мРНК генов паннексинов человека и мыши и экспериментально показано (ОТ-ПЦР и Нозерн-гибридизация) существование двух изоформ мРНК для каждого из генов PANX1 и PANX2 и одной изоформы для гена PANX3 человека Впервые определена полная нуклеотидная последовательность кДНК и экзон-интронная структура генов PANX1, PANX2, PANX3, а также последовательности и структура ортологичных генов мыши Впервые установлен профиль тканеспецифичности экспрессии генов паннексинов у человека ген PANX1 экспрессируется во всех анализированных тканях, хотя и в разной степени, а для генов PANX2 и PANX3 характерен более узкий профиль экспрессии Методом биоинформатического анализа выявлены вероятные функциональные домены в аминокислотных последовательностях белков PANX1, PANX2, PANX3 С помощью гибридизации in situ установлена тканевая локализация белка PANX1 в тканях хрусталика глаза и эмбриона мыши
, ч »-iuHJ"")! ***
" " г
Практическая значимость работы.
Щелевые контакты имеют существенно важное значение для функционирования многоклеточных организмов, что подтверждается многочисленными фенотипическими аномалиями, возникающими при их повреждении у человека (глухота, неиропатия, катаракта и другие) Полученные в ходе диссертационной работы данные позволили выявить кандидатные гены, повреждения в которых могут приводить к развитию этих заболеваний Обнаружение ортологов паннексинов у мыши позволяет использовать этот модельный объект для будущих исследований заболеваний человека, связанных с дефектами паннексинов Установление структуры генов PANX1, PANX2 и PANX3 и их продуктов позволяет приступить к детальному мутационному анализу генома в выборках пациентов, заболевание у которых может быть связано с мутациями в генах паннексинов Это позволит разработать стратегии диагностики, лечения и профилактики заболеваний, связанных с носительством определенных вариантов генов паннексинов у человека
Основные положения выносимые на зашиту:
1 Обнаружено новое семейство генов позвоночных, названных паннексины
Гены паннексинов ортологичны генам иннексинов беспозвоночных,
кодирующих белки щелевых контактов
2 Установлена геномная организация генов PANX1, PANX2 и PANX3, выявлены
изформы мРНК всех паннексинов человека, а так же установлен уровень их
экспрессии и тканеспецифичность
3 Выявлены вероятные функциональные домены в аминокислотных
последовательностях белков PANX1, PANX2, PANX3 Все три белковых
продукта, кодируемые генами PANX1, PANX2 и PANX3 имеют четыре
трансмембранных домена, характерных для всех белков щелевых контактов
4 Выявлены гены-ортологи паннексинов человека в геноме мыши, что
позволяет использовать этот модельный объект для будущих исследований
заболеваний человека, связанных с дефектами паннексинов
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на следующих конференциях-
-
Washington, DC: Society for Ncuroscience, 2002.
-
ARVO-The Association for Research in Vision and Ophthalmology, 2005.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 2 докладов
Структура и объем работы Диссертация состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты с обсуждениями, выводы, список литературы (более 200 источников) Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 11 рисунков и 1 таблицу