Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМИ. В течение нескольких лет после клонирования генов, кодирующих транскрипционные фактори, был достигнут большой прогресс в понимании природы и роли этих факторов, которую они играит в процессах конститутивной, индуцибельной и тканеспецифичной экспрессии генов; показана их вовлеченность в онтогенез и другие патогенетические процессы. Кроме того, глубокое проникновение в молекулярные механизм функционирования этих факторов позволило получить детальную информации о том, как они осуществляют свои ре-гуляторные функции при сайт-специфичном связывании в пр^ио-tqphhx областях подконтрольных генов, каким образом осуществляется активация или репрессия транскрипции, или как они взаимодействуй с другими компонентами системы регуляции генной экспрессии. Более того, в ряде случаев идентифицированы районы индивидуальных фанторов, которые опосредупт эти эффекты, а также определены отдельные- аминокислоты, которые критичны для подобных Функций этих участков. Оказывается, что транскрипционные факторы имепт мультидоменнут организации, причем различные домены ыогут взаимодействовать с ДНК или белками. Изучение взаимодействий меяду различными транскрипционными фанторами, а такяе взаимодействий мемду ними и конралирувщими их функции белками требует более ком-плекскных подходов, чем изучение индивидуальных факторов. Однако на пути изучения йемпротеиновых взаимодействий воз-MosHo найти понимание механизмов, которые интегрирует физиологические сигналы с дифференциальной экспрессией rerfoa.
РАХ-гены принадлежат к одному из многочисленных классов
транскрипционных .факторов, и судя по пространственно-вре-
иенной картине экспрессии в развитии,- зволиционной консер
вативности, и связанными с мутациями в этих генах аномалия
ми развихия.они играшт ваянуи роль как в эмбриональный,
так и в постнатальный периоды ?яйвотнвх, ,.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.' Цельи данной работы явла-
- 4 -лось изцчение структурно-функциональной организации транскрипционного фактора РАХ8, представителя генного семейства РйХ. В частные задачи работы входило:
-
Клонирование и анализ кДНК РАХ8;
-
Анализ экспрессии РАХ8 in vivo;
-
Определение интрон-экзонной организации РйХВ-гёна;
-
Создание РЙХ8тспецифичного репортера и использование его в экспериментах по трансактивации для выяснения трансак-тивирующего потенциала РАХ8.
-
Выяснение структурно-функциональной организации РЙХ8: локализация активирующего транскрипции донена ( доменов ).
-
Выяснение трансактивирцичей способности РАХ8 в зависимости от контекста промотора.
-
Определение возможных регуляторов РАХ8.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТИ. Клонированы и охарактиризованы 5 изоформных кДНК транскрипционного фактора РАХ8. Определена стрдктура кДНК РАХ8: показано расположение кодона инициации трансляции и стоп-кодона, роїуА-сигнала. На основании изучения геномной организации гена РЙХ8 показан механизм осуществления дифференциального сплайсинга ц РАХ8. Определено положение 11 экзон/интронных границ в гене РАХ8. Показана экспрессия изофориних кДНК-транскриптов in vivo. Изолирован .предполагаемый промоторный регион РАХ8 гена. Создана система для тестирования в киль-туре клеток клонированных продуктов гена РАХ0, Показан различный трансактивирнвщий потенциал изофори РАХ8. Определены доиен, ответственный за активацию транскрипции, и предполагаемый транскрипционный репрессор. Показана зависимость трансакти'вирупией способности С-концевого района РАХ8. от контекста активирувного промотора и ДНК-связывавцего доиена .транскрипционного фактора. Определены 2 предполагаемых регулятора РАХВ-продуктов. > , .
АПРОБАЦИЯ РАБСТВ, Материалы диссертации были представлены на конференциях Hous Molecular Genetics ( Cold Spring Harbor, Neu York,І392 ),Ferst ERBL Beating on transcription ( Heidelberg,1994 ) и международном симпозиуме " Иолекуляр-ная генетика и биотехнология б оценке и изменений геномов сельскохозяйственных животных " < Санкт-Петербург,1994г.).
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опыбликовани 4
работы. .
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Работа изловена на 121 странице машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 5 таблицами и 27 рисциками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов.' Список цитируемой литературы насчитывает 182 источника.