Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Общие характеристики процесса развития злокачественных опухолей 7
1.1.1. Свойства злокачественных клеток 7
1.1.2. Этапность процесса возникновения злокачественных опухолей 9
1.2. Онкогены и гены-супрессоры опухолей 13
1.2.1. Онкогены 14
1.2.2. Гены-супрессоры опухолей 17
1.3. Спорадические и наследуемые формы рака 19
1.4. Рак молочной железы 22
1.4.1. Общая характеристика 22
1.4.2. Гены, участвующие в процессе развития рака молочной железы 23
1.4.2.1. Гены BRCA1 uBRCA2 и га возможные функции 24
1. 5. Связь генетического полиморфизма с риском развития злокачественных опухолей 38
2. Материалы и методы 43
2.1. Материалы 43
2.2. Методы 43
2.2.1. Компьютерный анализ 43
2.2.2. Выделение ДНК 43
2.2.3. Полимеразная цепная реакция 45
2.2.4. Рестрикция 47
2.2.5. Электрофорез в агарозном геле 48
2.2.6. Статистический анализ данных 49
3. Результаты собственных исследований 51
3.1. Связь аллельного состояния исследованных генов с риском развития злокачественных опухолей 51
3.1.1. Принципы отбора исследованных генов. Характеристики исследованных генов 51
3.1.2. Характеристики исследованных полиморфных сайтов 53
3.1.3. Характер распределения генотипов по исследованным полиморфным сайтам в популяции человека 54
3.1.4. Идентификация гаплотипов в генах BRCAl HBRCA2 58
3.1.4.1. Корреляционный анализ 58
3.1.4.2. Качественный анализ гаплотипов 60
3.1.5. Исследование связи сайтов и гаплотипов с риском развития злокачественных опухолей 64
3.1.6. Идентификация генотипов BRCA1 и BRCA2 с измененным риском развития злокачественных опухолей 68
3.2. Выявление генотипов, ассоциированных с риском развития рака молочной железы, по полиморяным сайтам при парном сочетании исследуемых генов 71
3.2.1. Анализ генетической структуры популяции 71
3.2.2. Генотипы, значимо влияющие на риск развития злокачественных опухолей 75
3.3. Группы ассоциаций полиморфных сайтов исследованных генов
с высоким и низким риском развития злокачественных опухолей 76
3.3.1. Отбор ассоциаций по трем полиморфным сайтам с высоким и низким риском развития опухоли 76
3.3.1.1. Ассоциации с низким риском развития опухоли 79
3.3.1.2. Ассоциации с высоким риском развития опухоли 80
4. Заключение 88
5. Выводы 96
6. Список литературы
- Этапность процесса возникновения злокачественных опухолей
- Гены, участвующие в процессе развития рака молочной железы
- Компьютерный анализ
- Принципы отбора исследованных генов. Характеристики исследованных генов
Введение к работе
Актуальность темы. Рак молочной железы относится к числу наиболее часто встречающихся форм злокачественных новообразований в большинстве развитых стран, а в структуре заболеваемости и смертности в России занимает 1-е место. В последние десятилетия заболеваемость населения России злокачественными новообразованиями молочной железы увеличилась более чем в 2 раза и имеет тенденцию к дальнейшему увеличению. Ежегодно частота случаев рака молочной железы увеличивается на 1,2%. В связи с этим исследование причин возникновения рака молочной железы становится все более актуальным.
Развитие злокачественных опухолей является многоэтапным генетически контролируемым процессом, представляющим собой микроэволюцию отдельных клеточных клонов в пределах опухоли. Прогрессия опухоли обуславливается возникновением мутаций в одном или нескольких генах, функционирующих кооперативно, и отбором мутантных клеточных клонов.
Расшифровка генома человека положила начало новому направлению молекулярной медицины - предиктивной медицине, имеющей две характерные особенности - индивидуальный подход к больному и предупредительный характер. Основу предиктивной медицины составляют определение генной сети заболевания, идентификация в ней центральных генов и генов-модификаторов, анализ ассоциации их полиморфизмов с конкретным заболеванием, разработка на этой основе комплекса профилактических мероприятий для конкретного пациента. Изучение факторов предрасположенности к онкологическим заболеваниям, в основе которых лежит полиморфизм ДНК, является актуальной областью исследований, позволяющей существенно расширить число полиморфных ДНК-маркеров, имеющих диагностическое значение.
В настоящее время имеются многочисленные доказательства того, что функциональное состояние генов BRCA1 и BRCA2 имеет определяющее значение в развитии рака молочной железы у женщин. Показано, что высоко-пенетрантные мутации в этих генах в гетерозиготном состоянии лежат в основе значительной доли семейных форм рака. Семейные формы возникают, как правило, с меньшей частотой, чем спорадические, и изучены достаточно хорошо. Спорадические формы рака молочной железы встречаются более чем в 90% случаев соответствующих заболеваний и изучены явно недостаточно. В этой связи основная социально значимая проблема связана с определением генетической природы спорадических форм злокачественных опухолей, в частности рака молочной железы.
Известно также, что белки BRCA1 и BRCA2 являются элементами полибелковых комплексов. Функциональная активность этих полибелковых комплексов зависит не только от аминокислотных последовательностей белков BRCA1 и BRCA2, но и от аминокислотных последовательностей других белков этих комплексов. В результате, основными кандидатами при формировании набора исследуемых генов являются те гены, продукты которых формируют совместно с белками BRCA1 и BRCA2 полибелковые комплексы.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлся популяционно-генетический анализ связи полиморфизма генов BRCA1, BRCA2, Р53, Р21, RAD51, NBS1, BARD1, MSH6, XRCC1 с развитием спорадических форм рака молочной железы у женщин. Для этого решались следующие задачи:
1. Определение частот аллелей и генотипов по полиморфным сайтам генов BRCA1, BRCA2, Р53, Р21, RAD51, NBS1, BARD1, MSH6, XRCC1 у женщин больных раком молочной железы и в контрольной группе.
Анализ генетической структуры по исследованным полиморфным сайтам у группы женщин больных раком молочной железы и в контрольной группе.
Идентификация ассоциаций полиморфных сайтов, статистически значимо влияющих на риск развития спорадических форм рака молочной железы у женщин.
Научная новизна. Впервые на примере анализа двадцати шести полиморфных сайтов в девяти генах-супрессорах опухолей идентифицированы генотипы с высоким и низким риском развития спорадических форм рака молочной железы у женщин. Практическая значимость. Выявление генотипов, ассоциированных с высоким риском развития спорадических форм рака молочной железы, позволяет осуществить раннюю диагностику предрасположенности к данной форме онкологического заболевания, а в дальнейшем возможно проведение необходимых профилактических мероприятий по предотвращению развития болезни. Этот подход может быть положен в основу выявления генетической предрасположенности к возникновению разных типов опухолей и позволит уменьшить существующий риск.
Этапность процесса возникновения злокачественных опухолей
Гены, относящиеся к группе генов, включенных в контроль развития злокачественных опухолей разных типов, тем или другим образом включены в контроль клеточного деления, и их можно разбить на 2 крупные подгруппы: онкогены и гены-супрессоры.
Онкогены - это клеточные или вирусные (вносимые вирусом в клетку) гены, экспрессия которых ведет к развитию новообразований. Гены-супрессоры (антионкогены, рецессивные опухолевые гены) - клеточные гены, инактивация которых резко увеличивает вероятность возникновения новообразований, а восстановление функции, наоборот, может подавить рост опухолевых клеток (Копнин Б.П., 2000).
Так называемые онкогены связаны с позитивным контролем клеточного деления и их суперактивность и, соответственно, суперпродукция способствуют протеканию процессов канцерогенеза. Напротив, для генов-супрессоров опухолей характерным является то, что их нормальные продукты блокируют клеточное деление и, соответственно, подавляют развитие злокачественных опухолей. Фактором, увеличивающим риск развития злокачественных опухолей, являются мутации в этих генах, которые либо подавляют активность соответствующих нормальных продуктов, либо приводят к их полному отсутствию в клетках. Мутации в генах, относящихся к этой группе, как правило, рецессивны и, следовательно, они наследуются и передаются от поколения к поколению (SherrC.J.,2004).
Понятие «онкоген» непосредственно связано с другим понятием «протоонкоген». Протоонкогены - это нормальные клеточные гены, усиление или модификация функции которых превращает их в онкогены. Продукты протоонкогенов являются нормальными участниками системы передачи сигналов к клеточной пролиферации на разных ее этапах, факторами роста, рецепторами факторов роста. При этом протоонкогены оказались первыми генами, которые были идентифицированы как клеточные гены, модификация которых может быть ключевым фактором канцерогенеза (Киселев Ф.Л., 1998). В настоящее время в геноме человека известно более 70 протонкогенов, изменения которых могут приводить к опухолевой трансформации.
Превращение протоонкогенов в онкогены может быть результатом различных мутационных событий. Этими событиями могут быть хромосомные абберации (транслокации), дупликации (амплификация генов) и точковые мутации.
Впервые роль транслокации в злокачественном перерождении клеток продемонстрировано в случае возникновения так называемой филадельфийской хромосомы, которая возникает в результате транслокации между девятой и двадцать второй хромосомой генома человека. Ее возникновение связано с развитием хронических миелоидных и частично острых лимфоидных лейкозов. В настоящее время показано, что при возникновении филадельфийской хромосомы происходит слияние структурных частей протоонкогена ABL, расположенного в 9-ой хромосоме, и гена BCR, локализованного в хромосоме 22. В результате, возникает химерный ген BCR-ABL, активность продукта которого существенным образом отличается от таковой в случае интактного гена ABL. Это приводит к стимуляции митотической активности клеток и снижению индукции апоптоза (Chissoe S.L. et. al., 1995).
Другим примером активации протоонкогенов в результате транслокации является протоонкоген BCL2, расположенный в 18 хромосоме. Его перемещение в 14 хромосому и постановка под контроль сильного промотора гена тяжелой цепи иммуноглобулинов приводит к его суперэкспрессии, и это является событием, способствующим развитию фолликулярной лимфомы (Bakhshi A. et. al., 1985; Bakhshi A. et. al., 1987). Аналогичным образом активируется и протоонкоген MYC (Halushka et. al., 1987; Pegoraro et al., 1984).
Показано, что влияние онкогенов на процесс злокачественного перерождения клеток может определяться увеличением их дозы, связанным с их амплификацией. Различные варианты гена MYC амплифицированы в мелкоклеточных карциномах легких (DePinho R.A. et. al., 1991), а также в других видах эпителиального рака. Амплификация онкогена NEU обнаружена в карциномах молочных желез, яичника и желудка (Slamon D.J. et. al., 1989; Zhou D.J. et. al., 1988; Paik S., 1992). Однако, наиболее часто изменения в протоонкогенах, сцепленные с переходом от нормальных к опухолевым клеткам, связаны с возникновением точковых мутаций.
Гены, участвующие в процессе развития рака молочной железы
В настоящее время обнаружен целый ряд генов, функция которых играет определенную роль в развитии злокачественных опухолей молочной железы. Эти гены относятся как к генам-супрессорам опухоли, так и онкогенам. В таблице 1.3. представлены характеристики генов, изменения функции которых связаны с развитием рака молочной железы.
Кроме того, характерной чертой некоторых, хорошо известных синдромов, которые характеризуются увеличением предрасположенности к развитию злокачественных опухолей, является увеличение вероятности возникновения также рака молочной железы. К числу таких синдромов относятся синдром Ли-Фраумени (Li-Fraumeni) (Evans S.C. et. al., 1998), обусловленный наличием «патогенных» мутаций гена Р53 в зародышевых клетках, синдромы Каудена (Cowden) (Schrager С.А. et. al., 1998) и Пейц-Джейкера (Peutz-Jegher) (Riley Е., Swift М., 1980), в основе которых лежат мутации в генах PTEN (Fackenthal J.D. et. al., 2001) и STKll (Schumacher V. et. al., 2005), соответственно. Увеличение риска развития рака молочной железы и яичника наблюдается также у больных атаксией -телеангиэктазией (ataxiaelangiectasia) (Athma P. et. al., 1996; Bridges B.A., Arlett C.F., 1992). Однако, основную роль в этиологии наследуемых форм этого заболевания играют гены BRCA1 и BRCA2. Гены BRCA1 и BRCA2 и их возможные функции
Выяснение причины высокой частоты возникновения рака молочной железы у евреев Ашкенази и концентрация этих случаев в определенных семьях привело в середине 90-х годов прошлого столетия к идентификации мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, наличие которых с высокой вероятностью приводит к развитию этого типа опухоли. В гене BRCA1 этими мутациями оказались выпадение аденина и гуанина в 185 положении и вставка цитозина в 5382 положении. В случае гена BRCA2 такой «патогенной» мутацией являлось выпадение тимина в 6174 положении. Гетерозиготные носители этих мутаций характеризуются высоким риском развития рака молочной железы и/или рака яичника (у женщин), и рака простаты (у мужчин) (Langston A.A. et .al., 1996; Nastiuk K.L. et. al. 1999).
Исследования других этнических групп позволило выделить и другие «патогенные» мутации в генах BRCA1 и BRCA2, наличие которых значительно увеличивает риск развития опухолей у их носителей (Гарькавцева Р.Ф., Гарькавцев И.В., 1999; Hamann U. et. al., 1997; Szabo C.I., King M.C., 1997; Gorski B. et. al., 2000; Sarantaus L. et. al., 2001) (Таблица 1.4.). Таблица 1.4. Основные «патогенные» мутации в генах BRCA1 и BRCA2 (Nagy R., 2004)
Проведенная оценка показала, что частота мутаций в генах BRCA в общей популяции лежит в пределах от 0,001 до 0,002 (Claus Е.В. et. al., 1991; Ford D. et. al., 1995), хотя в некоторых популяциях, таких как, евреи Ашкенази и исландской популяции, эта частота оказывается существенно выше (Roa В.В. et. al, 1996; Struewing J.P. et. al., 1997).
Развитие рака молочной железы у носителей «патогенных» мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 часто сопровождается развитием рака яичника (Piver M.S. et. al., 1993; Narod S. et.al., 1994). Другой особенностью наследуемого рака молочной железы, связанного с мутациями в этих генах, является его развитие в молодом возрасте (Neuhausen S. et. al, 1996; Offit К. et. al, 1996). Наряду с ранним раком молочной железы и яичника носители мутаций в BRCA1 и BRCA2 генах характеризуются повышенным риском развития других типов опухолей, таких как рак фаллопиевых труб, рак поджелудочной железы, рак желудка и рак гортани (The Breast Cancer Linkage Consortium, 1999; Brose M.S. et. al., 2002). У мужчин «патогенные» мутации в этих генах приводят к увеличению риска развития злокачественной опухоли простаты (Struewing J.P. et. al., 1997).
Значения пенетрантности для «патогенных» мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 меняются в широких пределах при переходе от одной исследованной популяции к другой. Так, при исследовании семьи с множественными случаями заболеваний показано, что значение вероятности развития рака молочной железы у женщин-носителей мутаций в BRCA1 и/или BRCA2 генах лежит между 0,7 и 0,85 (Easton D.F. et. al., 1993; Struewing J.P. et. al., 1997). Однако, если риск развития опухоли у носителей мутаций в гене BRCA1 оценивался без учета семейной истории этого заболевания, то величина этого риска снижалась и оказывалась равным 0,65 для мутаций в гене BRCA1 и 0,45 для мутаций в гене BRCA2 (Antoniou А.С. et. al., 2003).
Компьютерный анализ
Выделение ДНК из лейкоцитов крови проводили с помощью набора реагентов Diatom DNA Prep 200 (фирма Изоген). Этот набор основан на использовании Лизирующего реагента с гуанидинтиоционатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбизации клеточного дебриса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии Лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoS - сорбенте (специально обработанные кислотами и кальцинированные стеклянные шарики), затем легко отмывается от белков и солей спиртовым раствором. ДНК, элюированная из сорбента ЭкстраГеном Е, может быть использована при дальнейшем анализе.
Ход эксперимента: 1. К 200 мкл исследуемой пробы добавляли 800 мкл Лизирующего реагента и тщательно перемешивали; 2. Добавляли 40 мкл суспензии сорбента NucleoS и перемешивали 10 минут на ротаторе; 3. Центрифугировали в течение 10 секунд при 5000 оборотов в 1 минуту; 4. Удаляли супернатант с помощью водоструйного насоса; 5. К осадку добавляли 400 мкл Лизирующего реагента, тщательно перемешивали на вортексе до полного гомогенного состояния; 6. Добавляли 1 мл Солевой буфер, перемешивали содержимое пробирки на вортексе, центрифугировали 10 секунд при 5000 оборотов в минуту, удаляли супернатант; 7. Повторяли пункт 6 два раза; 8. Сушили осадок при температуре 65 С в течение 3-4 минут; 9. Добавляли 100-200 мкл ЭкстраГена Е, перемешивали на вортексе и термостатировали 4-5 минут при 65 С, затем снова перемешивали на вортексе; 10. Центрифугировали в течение 1 минуты при 10000 оборотов в минуту; 11. Супернатант с ДНК переносили в чистую пробирку и хранили при температуре -20 С; Состав буферов и растворов: 1. Лизирующий реагент: 5 М гуанидинтиоцианат, 20 мМ ЭДТА, 100 мМ трис-HCI, рН 6,4 и 1%-ный тритон Х-100; 2. Солевой буфер (10х): 1 М NaCI и 1 М KCI; 3. Суспензия ЭкстраГен Е: 10%-ная (w/v) смесь ионообменников (типа Chelex), 0,02% красителя Orange G и 0,01% тритона Х-100.
Анализ полиморфизма осуществляли с помощью двух методов: ГШР-ПДРФ (RFLP) и ПЦР с модифицированными праймерами (dCAPS). Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе AMPLY 4 фирмы «Биоком». Для проведения реакции использовали набор реагентов GenePak PCR Core (фирма «Изоген»), Этот набор представляет собой лиофилизованные сухие смеси. Каждая пробирка с готовой смесью содержит ингибированную для «горячего старта» Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, lu, 200 мкМ и 2,5 тМ, а также оптимизированную буферную систему.
Состав буфера (10х): 600 тМ Трис HCI рН 8,8; 150 mM (NH4)2S04; 200 тМ Triton XI00. В пробирки с сухой смесью добавляли ПЦР-растворитель, 0,5 мкМ праймеров, 100 нг ДНК и 1 каплю Масла PCR Oil (около 20 мкл). Конечный объем реакционной смеси 20 мкл.
В таблице 2.1. показаны использованные в экспериментах праймеры для каждого исследованного полиморфного сайта, а также температура отжига для каждой пары праймеров и размер получаемых фрагментов.
Принципы отбора исследованных генов. Характеристики исследованных генов
В стабильной панмиктической популяции пропорция генотипов подчиняется закону Харди-Вайнберга. Отклонение от равновесного соотношения частот генотипов свидетельствует о наличии селективных преимуществ отдельных генотипов, различий в их приспособленности.
В таблице 3.3. представлены наблюдаемые и теоретически ожидаемые частоты генотипов по исследованным полиморфным сайтам. Видно, что для всех сайтов не наблюдается статистически значимых различий в распределении генотипов как в группе больных, так и в контроле, что свидетельствует о равновесном состоянии этих аллелей в исследованных группах.
Причина такого совместного наследования группы полиморфных сайтов в гене BRCA1 остается неясной. Возможно, в основе этого явления лежит адаптивный процесс, сопутствовавший дифференциации популяций человека. Однако группа совместно наследуемых сайтов включает в себя и «молчащие» сайты, когда замена нуклеотида не приводит к замене аминокислоты (Si, S2, Se). Эти функционально идентичные сайты исключены из дальнейшего анализа, а также «молчащие» сайты D в гене BRCA1 и К в гене Р53. Для упрощения представления экспериментальных данных, мы объединили сцепленные сайты (S3, S4, S5, S7) в единый сайт, обозначив его буквой S.
Аналогичные результаты получены нами для двух сайтов в гене BRCA2 - М, М2, которые показали абсолютно идентичное распределение в анализируемых выборках больных и здоровых (Таблица 3.6.). Далее мы будем обозначать эти сайты буквой М.
В этой таблице даны фактические и теоретически ожидаемые частоты генотипов у больных и в контроле. Для анализа различий этих частот генотипов использовался критерий Колмогорова-Смирнова. Полученные данные показывают, что как в группе больных (л.2=0,039; Р 0,05), так и в контрольной группе (А.2=0,018; Р 0,05) различия между теоретически ожидаемым и фактическим распределением генотипов статистически не значимы.
Таким образом, строго идентифицированные нами гаплотипы достаточно хорошо описывают генетическую структуру популяции, как в случае больных, так и в контроле. Однако это не исключает существование других гаплотипов. В таблице 3.9. представлены варианты гаплотипов, наличие которых в популяции возможно, но не доказано. Частоты этих возможных вариантов гаплотипов невелики. Все они представляют различные сочетания редких вариантов рассмотренных полиморфных сайтов.
Ген BRCA2. Среди наблюдаемых генотипов по гену BRCA2 три являются гомозиготами (MM NN GG HH YY; MM NN GG HH yy; MM NN gg HH YY) по всем исследованным полиморфным сайтам, а пять гетерозиготны лишь по одному из исследованных сайтов (ММ NN GG HH Yy; ММ NN GG Hh YY; Mm NN GG HH YY; MM NN Gg HH YY; MM Nn GG HH YY). Это позволило идентифицировать шесть гаплотипов, представленных в таблице 3.10.
По идентифицированным гаплотипам гена BRCA1 можно отметить, что хотя распределение частот гаплотипов у больных и здоровых значимо не различается (Х.2=0,45; Р 0,05), наблюдается тенденция к увеличению частоты встречаемости редких гаплотипов (А В S С f; А В S с F) в группе больных по сравнению с контролем (Рисунок 3.4.). Количественное различие встречаемости гаплотипов у больных по сравнению с контрольной группой оказалось удобно характеризовать коэффициентом ассоциации Юла, который в данном случае представляет собой отношение
Похожие диссертации на Связь полиморфизма генов-супрессоров опухолей с развитием спорадической формы рака молочной железы у женщин
