Содержание к диссертации
Введение 6
Глава 1. Характеристика растительных защитных ответов 9
1.1. Механизмы вертикальной устойчивости 9
Гены авирулентности . 9
Гены устойчивости растений 12
Характеристика основных защитных ответов 19
Участие цитокинина в защитных реакциях 23
Биология патогенов p. Phytophthora. 27 1.3.1. Механизмы инфицирования растений 29
1.3.1.1. Гены Phytophthora, принимающие участие в патогенезе 32
Расо-специфичные R- и avr-гены 33
Элиситоры Phytophthora 33 1.3.2. Зависимость патогенов рода Phytophthora от стеринов 36
1.4. Мутанты растений по биосинтезу стеринов 38
Заключение 46
Глава 2. Материалы и методы 48
Растительный материал 48
Агробактериальные штаммы 48
ИзолятыР. infestans 48
Изолят P. brassicae 49
2.5. Метод агробактериальной трансформации растений картофеля 49
2.6. Подтверждение трансгенной природы полученных 49
растенийметодом полимеразной цепной реакции (ГЩР)
2.7. Анализ экспрессии бактериального гена ipt в трансгенных 50
растениях картофеля
2.8. Тестирование трансгенных растений картофеля при заражении 51 вирулентным изолятом P. infestans
Методика заражения изолированных листьев 51
Отбор вирулентного изолятаР. infestans 51 2,9. Оценка реакции эксплантов растений картофеля на ионы 52 металлов
2.9.1. Подбор условий для проведения теста с ионами меди (сульфат 52
меди)
2.9.2. Подбор условий для проведения теста с ионами никеля 52 (хлорид никеля)
2.10. Получение растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому 53
антибиотику нистатину
Культивация растений арабидопсиса в асептических условиях 53
Получение каллусных тканей арабидопсиса 53
2.10.3. Подбор сублетальной концентрации нистатина для 53
микрокаллусов арабидопсиса
2.10.4. Регенерация растений арабидопсиса из устойчивых к 53
нистатину каллусных линий
2.11. Проверка сохранения признака «устойчивость к нистатину» у 54
полученных растений
Анализ устойчивости к нистатину у растений-регенерантов 54 при вегетативном размножении
Анализ устойчивости к нистатину у растений-регенерантов 54 при половом размножении
2.12. Оценка восприимчивости растений арабидопсиса к расе Р. 54
brassicae
2.13. Анализ влияния стеринов на рост мицелия и образование 55
конидий у P. brassicae, P. infestans
Глава 3. Результаты. 56
3.1. Реакция трансгенных растений картофеля с геном ipt на 56
биотический стресс - заражение вирулентным изолятом P. infestans
3.1 Л.Получение трансгенных растений с геном синтеза цитокининов 56 ipt методами агробактериальной трансформации
3.1.1.1. Агробактериальная трансформация междоузлий растений 56
картофеля
3.1.1.2. Подтверждение трансгенной природы полученных 58
регенерантов с применением метода ПЦР с праймерами к гену nptll
Изучение экспрессии гена ipt в трансгенных растениях 58 картофеля
Изучение реакции трансгенных ipt растений картофеля на 65 абиотический стресс - соли металлов
Подбор концентраций солей меди и никеля для проведения 65 теста
Анализ реакции эксплантов трансгенных растений картофеля 68 на среде с солями меди и никеля
Отбор вирулентного изолята P. infestans 73
Результаты заражения изолятом №5 P. infestans трансгенных 75 растений картофеля
3.2. Изучение влияния различных доз стеринов на скорость роста 77
мицелия P. infestans и Р, brassicae в условиях in vitro и in vivo
3.2.1. Влияние стеринов, содержащихся в среде для культивации, на 78 эффективность развития P. infestans и P. brassicae
3.2.2. Получение растений арабидопсиса, устойчивых к нистатину, 81
методом клеточной селекции
Подбор условий для селекции микрокаллусов арабидопсиса 83 на устойчивость к нистатину
Получение каллусных линий, устойчивых к нистатину 86
Регенерация побегов и их укоренение 86
Анализ сохранения признака «устойчивость к нистатину» у 87 регенерированных растений при вегетативном размножении
Анализ сохранения признака «устойчивость к нистатину» у 89 потомков устойчивых растений Ro от самоопыления
Изучение реакции на заражение патогеном P. brassicae 92 растений, полученных методом клеточной селекции
Изучение реакции на заражение патогеном Р, brassicae у 93 растений - Т-ДНК инсерционных мутантов по генам синтеза стеринов
3.2АЛ. Отбор гомозиготных по вставке Т-ДНК растений 93
3.2.4.2. Заражение мутантов dwfl патогеном P. brassicae 94
Глава 4. Обсуждение 96
Заключение 104
Выводы 107
Список сокращений 109
Приложение 111
Список литературы 120
Введение к работе
Проблема получения устойчивых к различного рода патогенам растений по-прежнему остро стоит перед исследователями, несмотря на успехи, достигнутые в последние годы* В частности, патогены рода Phytophthora (например, P. infestans) ежегодно наносят ощутимый ущерб сельскому хозяйству. Помимо традиционных приемов селекции для отбора устойчивых к тому или иному патогену растений, перспективным является использование биотехнологических методов. Как правило, в отношении поражаемых Р. infestans растений (картофеля, томатов) селекционные методы работы направлены на интродукцию в культурные растения генов устойчивости к заболеванию (R-генов) от диких форм растений. R-гены являются необходимыми для развития т.н. вертикальной устойчивости, которая, однако, сравнительно быстро преодолевается патогеном за 1-2 сезона. Более надежной представляется получение форм растений с горизонтальным типом устойчивости, однако, генетические механизмы данного типа устойчивости до сих пор неизвестны. Показано, что на устойчивость растений к патогенам (а также, абиотическим факторам среды) влияет физиологический статус растения, например, гормональный баланс, содержание вторичных метаболитов, фитостеринов и т.д. Так, в ряде модельных систем (авокадо Persea americana - патоген Colletotrichum gloeosporoides; растения табака Nicotiana tabaccum - гусеницы Manduca sexto) показано, что повышенный уровень одного из растительный гормонов - цитокининов, повышает устойчивость растений к различного рода стрессам (абиотическим и биотическим - заражению грибами, вирусами, вредителям), но для; взаимодействия с патогенами рода Phytophthora это явление не изучено. Изучение влияния цитокинина in vivo возможно, повышая его уровень добавлением экзогенно, на мутантах со сверхпродукцией цитокининов, в том
числе, растениях, экспрессирующих ген синтеза цитокининов ipt
Agrobacterium tumefaciens. Также, известен факт зависимости роста и размножения патогенов родов Phytophthora и Pythium от экзогенных стеринов, однако, степень их зависимости и корреляция между уровнем устойчивости растений и содержанием стеринов - открытый вопрос. В нашей лаборатории с помощью методов клеточной селекции на устойчивость к полиеновым антибиотикам, были получены растения картофеля и томатов, с повышенным уровнем сопротивляемости к фитофторозу. Однако, взаимосвязь этих событий (устойчивость к полиеновому антибиотику - измененный состав стеринов -устойчивость к патогену) не была подтверждена в ряду поколений в связи со сложностью генетического анализа на упомянутых объектах. Решить эту проблему возможно с использованием хорошо изученного модельного растения Arabidopsis thaliana, для которого описан патоген из рода Phytophthora - P. brassicae. Таким образом, целью нашей работы являлось изучение влияния измененного состава цитокининов у растений картофеля с бактериальным геном синтеза цитокининов ipt на устойчивость к заражению вирулентой расой Phytophthora infestans и солям никеля и меди, а также, измененного состава стеринов A. thaliana на устойчивость к P. brassicae:. Соответственно, задачами работы являлось:
получение трансгенных растений картофеля с бактериальным геном биосинтеза цитокининов ipt и анализ его экспрессии;
анализ полученных растений на устойчивость к заражению P. infestans',
подбор условий для анализа устойчивости растений картофеля к абиотическому стрессу - солям меди и никеля, и оценка устойчивости полученных трансгенньгх растений;
получение растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому антибиотику
нистатину, и проверка стабильности признака в морфогенетическом цикле
«каллус-растение-каллус», а; также, в, ряду половых поколений при
самоопылении;
5) оценка устойчивости полученных растений арабидопсиса и Т-ДНК инсерционных мутантов арабидопсиса по генам биосинтеза стеринов из коллекции Arabidopsis Stock Research Institute к патогену P. brassicae.
