Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 8
1. Белки клеточной стенки Е.coli, участвующие в фаговой адсорбции и транспорте колицинов 8
1.1. Пориновые белки 9
1.2. Белки-рецепторы фагов и колицинов, участвующие в специфическом транспорте 12
1.3. Транспорт колицинов 14
1.4. ТопВ иТо1А -зависимые транспортные системы и импорт макромолекул ъЕ.соИ 15
1.5. Участие белков ЕхЬВ и ExbD в ТопВ зависимом транспорте 16
1.6. Продукты генов tol и импорт макромолекул в Е. coli 17
1.7. Механизм транспорта макромолекул системой Tol 19
1.8. Взаимозаменяемость белков TonB-ExbB-ExbD и TolAolQolR 19
1.9. Многостадийность фаговой инфекции 20
2. Элементы системы адаптация клеток Escherichia coli к воздействиям окружающей среды 23
2.1. SOS система 23
2.2. Регуляция синтеза капсульного полисахарида 29
2.2.1. Основные элементы регуляции синтеза колановой кислот 29
2.2.2. RcsC и RcsB как пара сенсор - эффектор .31
2.2.3. Протеаза Lon контролирует уровень RcsA 33
2.2.4. Стимуляция транскрипции генов cps зависит от взаимодействия RcsA с RcsB 34
2.2.5. Модель регуляции синтеза клеточной капсулы 34
2.3. Переход в стационарную фазу как последняя стадия адаптивного ответа 36
2.3.1. RpoS -зависимые гены 37
2.3.2. RpoS-зависимые гены могут быть элементами других регуляторных систем 41
2.3.3. Регуляция гена RpoS 42
2.3.4. Как RpoS контролирует экспрессию генов 47
III. Материалы и методы 49
1. Бактериальные штаммы, плазмиды и бактериофаги 49
2. Питательные среды и реактивы 60
3. Перенос мутации из плазмиды в хромосому 61
4. Генетические методы конструирования штаммов 61
5. Проверка утилизации витамина Віз 62
6. Методы работы с ДНК 62
7. Фракционирование компонентов оболочки клеток 64
8. Анализ клеточных белков 64
9. Анализ адсорбции фага С1 65
10. Комплементационный анализ мутантов по фаговой адсорбции 65
11. Качественное и количественное определение эффективности индукции профага ля. а 65
12. Спот-тест и количественное определение эффективности индукции профага А, 67
13. Определение эффективности адсорбции фага лямбда 67
IV. Результаты и обсуждение 68
1. Изучение клеточного генетического контроля адсорбции бактериофага С1 68
1.1. Выделение бактериофага С1 и получение мутантов Е. coli, дефектных по адсорбции фага С1 68
1.2. Клонирование генов «УМ. и dcrB 68
1.3. Локализация генов dcrA и dcrB внутри клонированных фрагментов ДНК и на физической карте E.coli 69
1.4. Анализ нуклеотидной последовательности генов dcrA и dcrB 72
1.5. Оперонная организация экспрессии гена dcrB 73
1.6. Идентификация продукта гена dcrB 74
1.7. Локализация белка DcrB в мембранных фракциях 75
1.8. Продукт гена dcrA не влияет на экспрессию dcrB 76
1.9. Утилизация витамина Ві2в мутантах dcrB и dcrA 78
1.10. Плейотропные эффекты, вызванные инактивацией или увеличением дозы гена dcrA в клетке 78
1.11. Построение модели адсорбции бактериофага С1 79
1.12. Изучение участков бактериальной хромосомы на 63.1 и 77.8 минутах карты E.coli, прилегающих к генам dcrA и dcrB 82
2. Изучение SOS-незавкеимых клеточных функций, контролирующих индукцию лямбдоидныж фагов 86
2.1. Клонирование генов Escherichia coli, сверхэкспрессия которых приводит к RecA- независимой индукции профага лямбда 86
2.2. Избыток RcsA и DsrA в клетке приводит к RecA-независимой индукции профага лямбда 88
2.3. Влияние сверхпродукции RcsA и DsrA на индукцию других лямбдоидных фагов 90
2.4. Количественное определение эффективности RecA-независимой индукции профага лямбда 91
2.5. Роль генов rcsA,rcsB и dsrA в RecA-независимой индукции профага лямбда 98
2.6. Эффективность RcsABC пути индукции профага лямбда при сверхпродукции cl-X репрессора 100
2.7. Индукция профагов - естестенный ответ клетки на различные РС с ви-ЗДСИи 1ВЙЛ 104
V. Основные результаты и выводы 110
VI Литература 111
- SOS система
- Бактериальные штаммы, плазмиды и бактериофаги
- Локализация генов dcrA и dcrB внутри клонированных фрагментов ДНК и на физической карте E.coli
- Индукция профагов - естестенный ответ клетки на различные РС с ви-ЗДСИи 1ВЙЛ
SOS система
Воздействие на клетки К coli ДНК-повреждающих или задерживающих репликацию веществ вызывает индукцию ряда клеточных функций - т.н. SOS ответ, способствующий выживанию клетки в этих условиях. SOS ответ включает увеличение экспрессии более 20 генов (Kenyon and Walker, 1980; Walker, 1984, 1996). Среди них ,в частности, гены uvrAB (Kenyon and Walker, 1981), sulA (Huisman and D Ari, 1981), umuDC (Bagg et al., 1981), himA (Miller et al., 1981), uvrD (Siegel, 1983), ruv (Shurvinton and Lloyd, 1982), recA (Casaregola et al., 1982) и recN (Lloyd et al., 1983). Ключевыми регуляторными элементами SOS системы являются белки RecA и LexA. Основные SOS ответы включают индукцию нескольких репарационных систем (Uvr-зависимую эксцизионную репарацию, UmuCD-зависимую), индукцию различных мутационных систем (UTM, UVM, ROSE и др.) задержку клеточного деления с целью создания условий для завершения репарационных процессов. (Walker, 1984, 1985, 1996; Hxmayun, 1998,). Общая схема индукции SOS системы показана на рис.П-1.
Одноцепочечные фрагменты ДНК, результат действия ДНК повреждающих веществ, активируют RecA (активированный RecA затемнен), который, в свою SOS гены очередь, стимулирует автопротеолитическое расщепления репрессора SOS генов белка LexA. Детали механизма индукции SOS ответа обсуждаются в тексте.
В неиндуцированной клетке LexA действует как репрессор SOS -индуцибельных генов, в том числе генов гесА и ІехА, взаимодействуя с операторными, последовательностями канонической формой которых является TACTGATATA-A-ACAGTA LexA представляет собой белок с молекулярной массой 22,700 Da (Brent and Ptashne, 1980; Little and Нarper, 1979, Walker, 1984, 1996).
Повреждение ДНК или нарушение репликации обычно приводит к образованию значительного количества одноцепочечных участков ДНК. Взаимодействие RecA с одноцепочечной ДНК активирует его для стимуляции автопротеолитического расщепления LexA. Активация RecA является обратимым процессом (Little, 1983) и, вероятно, связана с конформационными изменениями в молекуле RecA (Roberts and Devoret, 1983). В опытах in vitro активация RecA происходит, когда этот белок образует трехсоставной комплекс с одноцепочечной ДНК и нуклеозид трифосфатом (Roberts and Devoret, 1983). Роль нуклеозид трифосфата при генерации индуцирующего сигнала пока полностью не ясна. Существует много в основном косвенных данных что и др/гие белки, отличные от RecA и LexA, прямо или косвенно принимают участие в индукции SOS ответа. Так клетки, несущие мутации в гене ssb (кодирует белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК), имеют дефект в индукции некоторых SOS ответов (Vales et al., 1980). Исследования in vivo и in vitro свидетельствуют, что Ssb играет позитивную роль в расщеплении LexA и репрессора фага X способствуя активации RecA.(Whittier and Chase, 1983).
При возникновении одноцепочечных фрагментов ДНК концентрация интактного LexA начинает уменьшаться, экспрессия SOS генов, включая гесА, увеличивается и становятся заметными проявления различных SOS ответов. Обычно гены с промоторами, которые связывают LexA относительно слабо, индуцируются первыми. Если индуцирующая обработка достаточно сильна, то большее количество молекул RecA активируется и, как следствие, начинают экспрессироваться гены, которые сильнее репрессируются LexA. Активированный RecA способен также вызывать расщепление репрессоров различных лямбдоидных фагов и фага Р22 (Little, 1984, 1991; Roberts and Devoret, 1983). Расщепление LexA, как и репрессора фага X, происходит в месте пептидной связи -Ala-Gly- примерно в середине молекулы репрессора.
При прекращении действия индуцирующего сигнала и окончании репарации ДНК уровень LexA увеличивается и восстанавливается репрессия SOS генов.
Точные детали молекулярного механизма расщепления LexA и репрессора сі фага X полностью неизвестны. Показано, что данное расщепление in vitro в щелочных условиях может происходи i ь в том же месте пептидной связи даже при отсутствии RecA (Little, 1984) . Эти и другие данные позволили предположить, что активированный RecA действует не как протеаза, а взаимодействуя с SOS-репрессорами так изменяет их конформацию, что они aвторасщeпляютcя.(Little, 1991; Roland et al., 1992 Shepley and Little 1996).
В работе Kim and Little (1993) показано, что автопротеолитическое расщепление LexA и сі репрессора фага X является бимолекулярной реакцией. Реакции данного типа сходны с ферментативными реакциями в том, что в них вовлекаются два сайта белка LexA ,один из которых («активный сайт») выполняет роль фермента, а другой -субстрата. Авторы применили метод в котором используются белки, содержащие только один из этих сайтов (Zaug and Cech 1986). Активный сайт включает каталитический центр и связывающий карман, который необходим для оптимального расположения сайта расщепления по отношению к каталитическому центру. Авторы показали, что С-концевой фрагмент LexA работает как фермент, расщепляющий другие молекулы LexA (Kim and Little, 1993). Аналогично, С-концевой фрагмент репрессора фага X расщеплял молекулы LexA с той же эффективностью как это делал сам фермент LexA. Как отмечалось, сайт расщепления -Ala-84-Gly-85- лежит в середине аминокислотной последовательности LexA (Horii et al., 1981a). Активный сайт, атакующий пептидную связь, расположен, по крайней мере частично, в остатках Ser-119 и Lys-156 или вблизи них (Lin and Little, 1988, 1989). Ser-119, по всей видимости, атакует пептидную связь (Roland and Little, 1990), а Lys-156 должен быть депротеинизирован для продолжения реакции расщепления (Lin and Little, 1989). Можно добавить, что ДНК-связывающая последовательность LexA, по-видимому, расположена в его N-конце, так как укороченный на С-конец белок может репрессировать SOS гены in vivo (Brent, 1982; Horii et al., 19816; Krueger et al, 1983). С-концевой домен белка необходим для его димеризации (Walker, 1996).
Множество химических и физических воздействий на клетку вызывают индукцию SOS ответов (Bagg et al., 1981; Quillardet et al., 1982). Важно отметить, что сама репликация, по всей видимости, является необходимым условием индукции SOS генов. Показано, что индукция синтеза RecA при облучении клеток УФ светом полностью подавлялась, если блокировалась инициация или элонгация репликации (Salles and Dfais, 1984; Sassanfar and Roberts, 1990).
Помимо двух крайних состояний (полная репрессия и полная индукция) SOS -ответ может иметь множество промежуточных стадий. Сила индукции SOS ответа зависит от регуляции самих генов г ее А и lexA. Так как ген г ее А сильнее репрессируется белком LexA, чем сам ген lexA и многие другие SOS гены (Brent and Ptashne, 1981; Little et al., 1981), генерация слабого индуцирующего сигнала ведет к увеличению экешэессии некоторых SOS генов без существенного накопления RecA в клетке Большее количество ИНЛУНИПУЮПІЄГО сигнала ведет к усилению активации RecA и как следствие к увеличению его синтеза
Авторепрессия ІехА позволяет: во-первых, расширить границы индуцирующего сигнала, в которых SOS система может установить промежуточное состояние индукции (индукция части SOS-ответов); во-вторых, избегать полной индукции при слабом индуцирующем сигнале, т.к. сродство LexA к своему промотору слабее чем к промотору гесА; в-третьих, ускоренно возвращать систему в исходное состояние, когда индуцирующая обработка начинает ослабевать (Brent, 1982; Little, 1983).
В последние годы интерес исследователей к исследованию SOS системы не ослабевает. Продолжается изучение иугА,В-зависимой репарации (NER- nucleotide excision repaire), удаляющей различные повреждения ДНК как через «глобальную» репарацию, так и через репарацию связанную с транскрипцией. Новые данные подтверждают важность SOS индуцибельных генов UvrA,B для NER -репарации.(Сголу1еу &Hanavalt,1998). Выясняется, что SOS-функция иногда способна различать какие гены важнее индуцировать в зависимости от типа индуцирующего воздействия. Интересно, что индуцирующим сигналом некоторых SOS-функций может служить не только повреждения ДНК, но и, вероятно, трансляционный стресс, связанный с появлением большого количества дефектных белков. Этот стресс способен вызвать индукцию специфической мутационной системы (Humayun, 1998).
Бактериальные штаммы, плазмиды и бактериофаги
Плазмида pDR500 (rcsA+) бьша получена вставкой Pstl фрагмента pDR416 величиной 2 т. п. н. в уникальный сайт Pstl плазмиды pUC19. Данные гибридизационного и рестрикционного анализов показали, что отобранная плазмида несет ген rcsA (рис. Ш-1 А). Плазмида pDR50l (rcsA::ATn903) была получена вставкой Hindi фрагмента pUC-4K, содержащего АТп903 (Vieira and Messing, 1982), в сайт EcoRV плазмиды pDR500 (rcsA ), который расположен в центре гена rcsA. Дефектный транспозон АТпЯОЗ содержит только ген аминогликозид З -фосфотрансферазы, которая определяет устойчивость клеток к канамицину.
Для конструирования плазмиды pDRlOO (rcsA+ dsrA+ dsrB+) ДНК трансдуцирующего фага ЯЗВЗ из коллекции Kohara и pUC19 обрабатывались рестриктазами Pstl и EcoRI одновременно, смешивались и лигировались. Рестрикционный и гибридизационный анализы показали, что клонированный фрагмент ДНК содержит гены rcsA, dsrA и dsrB.
Плазмиды pDR200 (rcsA+) и pDR300 (dsrA+ dsrB+) были получены путем вставки Hindi и Hindl-EcoRI фрагментов pDRlOO (rcsA+ dsrA+ dsrB") в полилинкер pUC19 соответственно. Известно, что клетки Е. coli Kl2 становятся мукоидными, когда содержат несколько копий гена res A (Torres-Cabassa and Gottesman, 1987). Плазмида pDR300 (dsrA+ dsrB+), подобно плазмиде pDR200 (rcsA+), приводила к образованию слизистых колоний, но мукоидный фенотип в случае pDR300 (dsrA+ dsrB+) был выражен слабо и сила его проявления зависела от штамма используемых клеток. В работе использовались клетки С600 для отбора мукоидных трансформантов. Как ожидалось, pDR200 (rcsA ) и pDR300 (dsrA+ dsrB") содержали фрагменты хромосомной ДНК величиной 0.6 и 1.1 т. п. н. соответственно. Важно отметить, что плазмида pDR300 (dsrA+ dsrB+) помимо гена dsrA содержит ген dsrB. Оба гена кодируют малые РНК, как описано в работе Sledjeski and Gottesman (1995). Рестрикционная карта района, содержащего гены rcsA, dsrA и dsrB, показана на рис. III-1Б и полностью совпадает с данными, опубликованными ранее (Kohara et al., 1987; Sledjeski and Gottesman, 1995; Stout et al., 1991). Гены rcsA и dsrA, клонированные на плазмидах, были инактивированы in vitro вставкой Hindi фрагмента pUC-4K, содержащего ДТпШ, в pDR200 {rcsA ), обработанную EcoRV, и pDR300 (dsrA+ dsrB+), обработанную Bsu36I и затупленную Кленов фрагментом ДНК полимеразы. Немукоидные ApR KmR трансформанты клеток С600 были отобраны и рестрикционный анализ их плазмидной ДНК подтвердил инактивацию генов rcsA и dsrA вставкой ДТпШ.
Для определения минимального фрагмента клонированной ДНК в pDR300 {dsrA dsrB ), которая приводит к наблюдаемому фенотипу, ЕсоШ-Hincll фрагмент pDR300 {dsrA dsrB ) был вставлен в полилинкерный сайт плазмиды pGEM-7zf(-), обработанной рестриктазами ЕсоШ и Smal, одновременно. Полученная в результате плазмида pDR12 {dsrA dsrB ) обрабатывалась рестриктазами Sphl или Nsil. Окончание рестрикции проверялось электрофорезом. Затем плазмида обрабатывалась рестриктазами Xbal или Hindlll, соответственно. Минимизация фрагмента ДНК экзонуклеазой III проводилась с помощью системы Erase-a-Base согласно протоколу Promega Corporation. Величины делеций определялись электрофорезом линейной ДНК полученных плазмид.
Для клонирования гена с\ репрессора фага X фаговая ДНК обрабатывалась рестриктазой BgRl, смеитъалыь и лигировалась с ДНК pUC19, обработанной рестриктазой ВатЯІ Lac Ap трансформанты XL1-Blue проверялись на иммунитет к фагу X. Рестрикционный и гибридизационный анализы отобранной плазмиды pDRl (сl+) показали, что клонирован участок хромосомы фага X от 35,711 до 38,103 п. Н. (Daniels et al., 1983) (рис. Ш-2).
При количественном определении частоты индукции профагов необходимо устранить подрост лизогенных клеток при их высеве на газон с индикаторными клетками. Добавление ампициллина в среду предотвращает деление лизогенных Aps клеток, не затрагивая при этом размножение индуцировавшегося фага (Ogawa and Tomizawa, 1967). В связи с этим во всех плазмидах, используемых в анализе эффективности индукции, была проведена инактивация in vitro гена Ыа вставкой гена cat. Ген cat кодирует хлорамфеникол ацетилтрансферазу, которая определяет устойчивость клеток к хлорамфениколу (Close and Rodriguez, 1982). Вначале ген cat из Pcm4 был вырезан рестриктазой ВатШ. и вставлен в уникальный сайт ВатШ плазмиды pUC19. Из полученной плазмиды pDR19 (саҐ) ген cat вырезался рестриктазами Smal и ЯшсІІ одновременно и вставлялся в плазмиды pDR200 (rcsA ) и pDR201 (rcsA::ATn903), обработанные рестриктазой Seal, и в плазмиды pDR300 (dsrA+ dsrB+) и pDR301 (dsrA::ATn903 dsrB+), частично обработанные той же рестриктазой, из-за наличия другого сайта Seal вне гена Ыа. CmR трансформанты клеток С600 проверялись на чувствительность к ампициллину. Рестрикционный анализ отобранных плазмид pDR210 (rcsA+, blar.cat), pDR310 (dsrA+ dsrB\ blav.cat), pDR211 (rcsA::ATn903, blawcaf) и pDR311 (dsrA::ATn903 dsrB+, blar.cat) подтвердил вставку гена cat в сайт рестриктазы Seal внутри гена Ыа.
Локализация генов dcrA и dcrB внутри клонированных фрагментов ДНК и на физической карте E.coli
Детальные рестрикционные карты фрагментов бактериальной ДНК, клонированных на плазмидах рВСЗб и рВС605 были получены, с использованием рестриктаз ВатШ, EcoRV, Hindlll, BglU, Pvull, ЕсоШ, Kpnl и Pstl. Карты полностью совпадали с участками 63.1 и 77.8 мин. рестрикционной карты Kohara. Локализацию минимальных фрагментов ДНК, кодирующих гены dcrA и dcrB, проводили минимизацией исходных плазмид в несколько этапов, в результате которых был получен ряд плазмид, представленных на рис IV-1 и 2.
Для dcrA минимизацию осуществляли по следующей схеме. Из плазмиды рВСЗб были получены: рВС15 путем удаления 4 т.п.н. Kpnl фрагмента; рВС2 при удалении из рВС15 EcoRl фрагмента; рВС25 содержала 2.5 т.п.н. EcoRV фрагмент из рВС2 на векторе pUC19, обработанном рестриктазой Smal. Плазмида рВС25, при трансформации в щтамм с мутацией dcrА55, делала его чувствительным к фагу С1, тогда как рВС45 (сконструированная введением CAT элемента из рСМ7 в Hindlll сайт рВС25) оставляла щтамм устойчивым к С1 (Рис.ІУ-l.)
Плазмида рВС55 была сконструирована in vivo при двойной рекомбинации между плазмидой рВС2 и хромосомой штамма В6817. При введении этой плазмиды в мутанты dcrА55 не происходило комплементации по адсорбции и поддерживался фенотип Cmr (Рис IV-1).
Штаммы с мутацией dcrB5, в которые были введены плазмиды рВС762 (сконструированная при делетировании ЕсоЮ/ фрагмента из рБС60З) и рВС76З (полученная при делетировании Sml-Eco\05 фрагмента рВС605) становились С1s, тогда как при введении плазмиды рВС764, полученной при вставке RSM элемента (Km ) из pUC4K в Avalll сайт рВС763, фенотип Сls не наблюдался (Pис.1У-2.)
Локализация генов dcr А и dcrB на физической карте Е. coli была подтверждена гибридизацией фрагментов ДНК 2.5 т.п.н., клонированного в pdcrA+ (рВС25) и 3.1 Т.П.Н., клонированного в pdcrB+ (рВС763) с фагами Kohara, содержащими соответствующие участки хромосомы К coli. Плазмида pdcrA+ гибридизовалась с фагами Kohara 10В5 (456) и 8С5 (457), но не с другими используемыми фагами. ДНК плазмиды pdcrB+ гибридизовалась только с фагом 7Н7 (612) (Рис IV-1,2). Для получения штаммов с инактивированными генами dcrA и dcrB были сконструированы инсерционные мутанты по этим генам (см. материалы и методы) На первом этапе элементы СAT (Cm ) и RSM (Km ) были интегрированы, соответственно, в гены dcrA и dcrB в составе плазмид pdcrA+ (рВС25) и в pdcrB+ (рВС763) (при этом были нарушены комплементирующие способности этих плазмид). Мутации dcrAWv.CKT (Cm ) и fotf60::RSM (Km ) из плазмид dcrAr.CAT (рВС45) и dcrB60::RSU (рВС764) были введены в хромосому Е. coll. При этом полученные штаммы становились устойчивыми к С1. Результаты экспериментов по адсорбции С1 в соответствующие штаммы сведены в Табл.1У-1. Комплементационный анализ с использованием клонированных генов dcrA, dcrB и ЫиВ показал, что мутации dcrА20::САТ и crB60::RSM комплементируются только плазмидами, содержащими dcrA и dcrB, соответственно, хотя, как показано ранее, исходная точковая мутация dcrB5 комплементировалась как dcrA так и dcrB содержащими плазмидами.
Тем не менее, мутации dcrB5 и fcrB60::RSM сильно сцеплены генетически, и, вероятнее всего, инактивируют один и тот же ген. Различные результаты с мутациями dcrB5 и dcrB60yRSM могут отражать частичную (dcrB5) и полную (dcr60::RSM) инактивацию гена dcrB.
Таким образом, мы локализовали фрагменты с геном dcrA (2.5 т.п.н.) между кластерами metZnfucOADIKR и с геном dcrB (3 т.п.н.) между генамя ftsYEXи nikA. 1.4. Анализ нуклеотидной последовательности генов dcrA и dcrB. Нуклеотидная последовательность генов dcrA и dcrB была определена стандартными методами (см. Методы и материалы.). При сравнении результатов с данными EMBL/GenBank/DDBJ при помощи программы DNA-SUN (ГНИИ Генетика, Москва, 1994, версия 3.30) обнаружена идентичность между генами dcrA и sdaC (EMBL, ЕС233) и идентичность между геном dcrB и открытой рамкой считывания ORF_o203, лежащей между генами fisY и nikA (EMBL, YHHR-ECOLI), кодирующей гипотетический белок с мол. весом 19.8 кДа. Эти последовательности физически локализованы в тех же регионах, что dcrA и dcrB. Анализ аминокислотной последовательности, полученной из нуклеотидной последовательности dcrB показал (рис. IV-3), что DcrB, вероятно, содержит сигнальный пептид (19 аминокислот) на N-конце, который отщепляется во время экспорта через внутреннюю мембрану. Предполагаемый сигнальный пептид содержит три типичных участка: I) на N-конце имеются два заряженных аминокислотных остатка, R-2 и К-6; II) далее расположено гидрофобное ядро (от Y-7 до А-19); III) сигнальный пептид имеет следующую вторичную структуру alpha-helix, beta-sheet.
Индукция профагов - естестенный ответ клетки на различные РС с ви-ЗДСИи 1ВЙЛ
Можно с уверенностью предположить, что стабильность профага зависит от физиологического состояния клетки. В условиях, когда клетке грозит гибель, индукция профага обеспечивает возможность сохранить часть клеточной ДНК и передать ее другим клеткам. К настоящему времени был известен только SOS -зависимый механизм индукции профагов при возникновении повреждений ДНК. В ответ на появление одноцепочечной ДНК позитивный регулятор SOS ответа белок RecA стимулирует автопротеолитическое расщепление некоторых фаговых репрессоров, что и приводит к индукции профагов (Roberts and Devoret, 1983).
Другие клеточные ответы на стрессы окружающей среды, отличные от SOS ответа, возможно, также индуцируют различные профаги при вероятной гибели клетки. В лабораторных условиях эти предполагаемые системы индукции профагов, по-видимому, неэффективны л тех пор, пока нет соответствующих стрессовых условий. Можно предположить, что увеличенная доза гена вероятного индуктора может имитировать специфический ответ клетки, приводя, в частности, и к индукции профага.
В настоящей работе представлены данные, которые свидетельствуют о наличии у клеток Е. coli, помимо SOS системы, других регуляторных систем, влияющих на стабильность профагов. В частности, было обнаружено, что сверхпродукция RcsA, являющегося позитивным транскрипционным регулятором генов cps (Gottesman, 1995, Gottesman and Stout, 19911 Stout et al. 1991) и DsrA РНК - позитивного транскрипционного регулятора гена rcsA (Sledjeski and Gottesman, 1995), стимулируют ReeA-независимую индукцию профага X и других лямбдоидных профагов. RecA-независимая индукция профага X наблюдалась при наличии в клетке многокопийных плазмид, содержащих ген res А или близко лежащий с ним ген dsrA. В обоих случаях в LB бульоне при 30С количество инфекционных центров ХС+ и концентрация свободного фага ХС+ были в 10-100 DL3 больще по созвнению с этими величинами для
Экспрессия генов cps, кодирующих ферменты синтеза капсульного полисахарида, регулируется двухкомпонентной системой RcsC-RcsB, в которой RcsC имеет сходство с сенсорными белками типа гистидиновых киназ, а RcsB имеет сходство с ДНК-связьшающими эффекторами. (Gottesman, 1995; Gottesman and Stout, 1991; Gottesman et al., 1985). RcsB абсолютно необходим для экспрессии генов cps. RcsA и, возможно, RcsF (Gervais and Draper, 1992) являются добавочными транскрипционными активатороми. RcsA является нестабильным белком, который деградируется протеазойЬоп (Stout et al., 1991; Torres-Cabassa and Gottesman, 1987). Транскрипция rcsA негативно регулируется гистон-подобным белком H-NS, а DsrA РНК препятствует действию H-NS (Sledjeski and Gottesman, 1995). Примечательно, что в Lon- мутантах уменьщается вероятность лизогенизации фагом X (Lacogue et al. 1976).
Индукция профага к в RecA- клетках, в присутствии rc -несущей плазмиды, полностью зависит от наличия в клетке дикой аллели гена rcsB. Мутации rcsC137, lon и rcsAS вызывали одновременно с мукоидным фенотипом клеток RecA-независимую индукцию профага X. Как уже отмечалось, в клетках с мутацией в гене lon наблюдается более высокая экспрессия генов cps, чем в клетках с мутацией rcsA3 (Brill et al., 1988), но последняя приводит к более сильной индукции профага I. Данный факт косвенно свидетельствует, что индукция профага не является простым следствием транскрипционной активации какого- либо гена cps.
RcsABC-зависимая индукция профага, наблюдаемая в экспоненциальной фазе клеточного роста, зависит от концентрации репрессора в клетке. Можно предположить, что данная индукция идет или через снижение синтеза фагового репрессора с1 с промотора PRM, или через изменение активности репрессора при прямом взаимодействии с ним каких-либо клеточных белков, чей синтез индуцируется системой Res ABC. Второе предположение кажется более вероятным, так как мутация ind в фаге A.GE112, которая расположена в сайте расщепления репрессора и блокирует его авторасщепление, наиболее сильно снижает эффективность индукции профага. Вероятно, система RcsABC регулирует экспрессию какой либо другой, отличной от RecA копротеазы. Зная гомологию RcsA с членами семейства LuxR транскрипционных активаторов (Stout et al., 1991), можно предположить транскрипционную активацию гена этой гиротетической копротеазы. Более того, полная зависимость влияния RcsA на профаг от наличия в клетке интактного rcsB и эффект мутации rcsClSl также свидетельствуют в пользу данного предположения.
Индукция профага при сверхэкспрессии dsrA в экспоненциальной фазе роста зависит от наличия в клетке интактных аллелей генов rcsA и rcsB. Данный факт свидетельствует о действии DsrA РНК на профаг в эспоненциально растущих клетках через стимуляцию транскрипции res А. Этот вывод подтверждается полученными данными, что при сверхэкспрессии dsrA частота инфекционных центров меньше для любого профага Xind, чем для профага X. Однако при входе клеток в стационарную фазу развития, действие DsrA РНК на профаг, по-видимому, не зависит от системы RcsABC. Полученные данные позволяют допустить существование дополнительного, RcsABC-независимого пути индукции профага X посредством DsrA РНК. Более того, индукция профага при входе клеток в стационарную фазу развития не зависит от наличия в гене с1 репрессора фага лямбда тестированных мутаций ind. Вполне вероятно, что DsrA РНК влияет на стабильность профага в данной фазе клеточного развития на транскрипционном уровне. Можно предположить, что в этот процесс вовлечен гистон-подобный белок H-NS, который, как известно, накапливается в клетке в стационарной фазе развития (Dersch et al., 1993, Spassky et al., 1984) и, возможно прямо или косвенно предотвращает индукцию профага. Взаимодействие H-NS/DsrA регуляторной пары показано при регуляции ряда клеточных генов (Sledjeski and Gottesman, 1995). Возможно, что "эффект DsrA РНК" на профаг X происходит через ее позитивное влияние на трансляцию rpoS (Sledjeski et al 1996) Интересно отметить что экспрессия ruoS негативно регулируется H-NS также на посттранскрипционном уровне, однако его действие не зависит от DsrA РНК (Sledjeskietal., 1996).
В работе проведено исследование RecA-независимой индукции других лямбдоидных профагов. Из табл. IV-6 видно, что все тестированные лямбдоидные профаги ведут себя схожим образом с X. Вероятно, что RecA-независимая индукция профага через RcsABC и DsrA -контролируемые пути имеет место и в случае остальных членов лямбдоидного семейства.
Предположения о существовании RecA-независимых путей индукции различных профагов высказывались ранее М.А. Yarmolinsky 1966 и Retallak and Friedman 1995, в последней работе приведены данные о том, что 10S РНК, продукт гена ssrA, связывается in vitro с репрессором с1 и препятствует его присоединению к оператору OR2 на хромосоме фага X. Сходные результаты были получены при анализе репрессора SOS генов, белка LexA и репрессора с1 фага Р22 (Retallak and Friedman, 1995). Если транскрипция ssrA индуцибельна, то, возможно, с одновременным увеличением синтеза 10S РНК, будет происходить и индукция профага X. В данной работе мы предположили участие другой малой РНК, продукта гена dsrA, в регуляции развития фага.
Вполне вероятно, что индукция профага, помимо ее роли в спасении фага при возможной гибели клетки, имеет важное значение для клеточной популяции в целом. Например, если при индукции различных профагов происходит их неправильное вырезание из хромосомы клетки-хозяина, то это даст набор трасдуцирующих фагов, несущих различные участки хромосомной ДНК. Подобное "рассеивание" генов путем трансдукции может дать клеточной популяции определенное эволюционное преимущество (Campbell, 1969).
Различные адаптивные системы клетки, которые, как можно предположить, влияют на стабильность профагов, по-видимому, имеют разную эффективность действия. Даже внутри одной SOS системы отмечена различная эффективность индукции лямбдоидных профагов в зависимости от вида воздействий на клетку, и вида профага (Elespuru, 1984; Roberts and Devoret, 1983). В данной работе мы описали RecA-независимую индукцию профага X, которая в лабораторных условиях на несколько порядков ниже, чем SOS-зависимая индукция профага. Возможно, что клеточные адаптивные системы, вызывающие менее эффективную индукцию профагов, чем это делает SOS система, вовлечены в более тонкую регуляцию взаимодействия фага с клеткой-хозяином. Вполне возможно также и то, что в естественных условиях эффективность этой системы существенно отличается от наблюдаемой в лаборатории.
Изучение SOS индукции различных профагов внесло большой вклад в понимание механизма SOS ответа. Изучение механизма индукции профага через RcsABC и DsrA пути, может помочь в понимании природы сигнапа окружающей среды, приводящего к индукции синтеза капсульного полисахарида, регуляции стабильности профагов на разных стадиях развития клетки.
Можно предположить также существование SOS-независмых систем индукции профагов, отличных от описанных в работе. В частности, остается открытым вопрос о регуляции стабильности умеренных фагов других семейств Р2, Ми-1.