Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Проблема генетики морфогенеза является одной их ключевых в современной биологии. Наибольший" прогресс в этой области был достигнут при исследовании *_изотных организмов. Общепркзяанз концепция поэтапной экспрессии ядерных генов в ходе онтогенеза, обобщ. »: яя Л. PL Яорочкиным С19?7]. В исследованиях генетического контроля морфогенеза растения доминирует гипотеза Куперман С1984] о ключевых этапах в онтогенезе прохождение которых обеспечивает дальнейшее нормальное развитие. Мэрфогенез растений - это сложнейший процесс, включающий, по определения Синнота, т кие. явления, к-ік корреляции, полярность, дифференцировка, регенерация, формирование хи-ме-\ аномальный рост. Становление организма как целого регулируется последовательным включением в процессе морфогенеза групп генов. Генетические механизмы морфогенеза растений исследуются глазным образом в плане выявления роли ядерных генов на его отдельных этапад. Почти не исследована модифицирующая' и генетическая роль цитоплазмы растений з развитии, что определяет актуальность тематики, выбранной ыыи-для-исследования. Сравнительное изучение взаимодействия ядерных и цитоплазматических генов in vivo и in vitro даст вогмошзсть-значительно повысить эффективность биотехнологических методов в Фундаментальных и прикладных программах, за счет повышения компетентности экс-плантоа к индукции каллусных, клеточных культур, регенерантов, гаплоидных и дигаплоидных клеточных линий и целых растений и т.д. Детальное изучение взаимодействия генома и плазмона при фс ировании Щ/С у пиеницы позволит выявить цитоплазмы более пригодные для гибридного семеноводства.
Свяаь рабу/гы с крупиьми научиши программами, темами. Диссертационная работа выполнялась э рамках Комплексных республиканских програш фундаментальных исследований "Продуктивность растений" (N госрегистрации 013.0010215), "Генетические основы селекции растений (шифр 2.34.12, N госрегистрации 01. ЄЄ00.21736), "Биотехнология", а также Шждународной комплексной программы научного сотрудничества между ИГиЦ АНБ и Институтом генетики Болгарской академии наук.'
Цель и задачи исследования. Делью данной работы являлось выяеить закономерности взаимодействия генома и плазмона з детерминации морфогенеза и развития растений.пшеницы в условиях
- г -
in vivo и m vitro. ."
Для достижения цели решались следующие задачи:
-
Исследовать основные закономерности клеточной и тканевой дифференцировки спорофита у цит Плазматически замещенных линий пшеницы в сравнении с донорами ядра и цитоплазмы на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях.
-
Изучить эффекты ядерных и цитоплазматических генов в развитии мужской генеративной сферы растений пшеницы на уль-траетруктурном, клеточном и тканевом уровнях у фертильних эу- и аллоплаэматических линий пшеницы, а такХе растений с частичной стерильностью и ЦМС.
-
Исследовать особенности взаимодействия генома и плазмона в детерминации способности растений к пролиферации тканевых и клеточных культур растений в условиях культуры клеток и тканей.
-
Выявить цитоплазматические и ядерно-цитоплаэматические эффекты В процессах индукции морфогенеза и регенерации in vitro лз соматических и генеративных тканей растений пшеницы.
-
Провеети поиск генотипов с высоким эмбриогенным потенциалом в культуре пыльников среди сортов и ьидов пшеницы. На их основе создать новые модели для изучения цитоплазматических и ядерно-цитоплаэматических эффектов.
Научная новизна подученных результатов. Впервые показано взаимодействие генома и плазмона при формировании спорофитных и тканей пыльников растений пшеницы. Выявлена строго определенная последовательность структурных преобразований цитоплазмы и ее органелл в клеткдх различных слоев пыльника, свидетельствующая о дифференциальной активности ядерных генов и плазмогенов в процессе морфогенеза.
При замене собственной цитоплазмы на чужеродную отмечены отклонения в структуре клеток и последовательности активизации всех слоев стенки пыльника, микроспороцитов и микроспор. Oh. выражались в аномальной дегенерации тапеїума стерильных растений по сраві нию с фертильными, нарушениях в структуре пластид среднего слоя, задержке утилизации крахмала в пластидах фиброзного слоя и др.
Получеі: оригинальные данные об особенностях онтогенетического развития мужской генеративной эу- и аллоплазматических
линий пшеницы с различной фертильностью пыльцы, проявляемые на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях. Обнаружены изменения экспрессии ядерных генов, контролирующих развитие спороген-ной и спорофи^ной тканей, и их взаимгдействия у форм пшеницы с 1{КС. Данные- световой и электронной микроскопии позволили разделить цитоплазмы индуцирующие ЦМС. пс времени и характеру стерилизации пыльцы на три группы: 1) цитоплазмы, индуцирующие раннюю стерилизацию пыльцы; 2) цитоплазмы, индуцирующие позднюю дегенерации пыльцы; 3) цитоплазмы промежуточного, типа.
Сравнительное изучение ультраструктуры цитоплазмы и ее ор-ганелл в клетках микроспороцитов и микроспор у аллоп."азматичес-ки: линий пшеницы с различными цитоплазмами позволило выяснить отпельные критические згапы в развитии мужского гаметофита (поздняя профаза мейоза, одноядерные невакуолизированные микроспоры, переход от одноядерной к двуядернсй пыльце). У фертильних линий в эти периоды происходят онтогенетические преобразования цитоплазматичестх органе~л. Е пыльниках растений с ЦМС. именно на этих этапах наиболее отчетливо проявляются признаки деградации цитоплазмы и ее о, /анелл.
Получены новые данные, свидетельствуя дне о взаимодействии генома и плазмона при индуцировании морфогенеза в культуре in vitro. Показано, что замещение цитоплазмы на чужеродную сущест-. jhho изменяет параметры,. характеризующие способность растений к. шщкции морфогенетических структур при культивировании соматических и генеративных тканей.
На различных экспериментальных моделях впервые показано вл"-шие цитоплазмы и генотипа растений на эффективность пыльцевого эмбриогенеза в культуре пыльников. Выявлено дифференцированное влияние чужеродных цитоплазм на признаки, характеризующие морфогенез в культуре пыльников.
С помощью методов дифференциальных индексов и кластерного анализа исследованные цитоплазмы классифицированы на 5 групп, которые соответствуют их филогенетическому родству.
Показана тканевая и генотипическая специфичность индукции быстро растущих каллусных культур у пшеницы. Получены высоко эмбриогенные клеточные суспензии, длительное время сохраняющие способность к регенерации растений.
Проведен широкий скрининг генотипов с высоким эмбриогенннм
- A -потенциалом в культуре пыльников.среди различных видов пшениц. Выделены образцы с высоким уровнем токазателей, характеризующих способность растений к индукции пыльцевого эмбриогенеза.
Результаты, представленные в д сертационной работе, существенно дополняют представления о характере взаимодействия ядерной и цитоплазмати"еской генетических систем в диМеренци-ровке и развитии растений.
Практическая значимость полученных результате» _Практичес-кую. и теоретическую ценность имеют эксперт энтальные модели, созданные автором при выполития работы Они могут быть использованы для изучения ядерно -цитоплаэматических взаимодействий при формировании продуктивности растений, устойчивости к различным неблагоприятным факторам, для изучения биохимических механизмов взаимодействия генома и плазмона. Эти модели включают новую серию аллоплаэматическйх линий, полученные на основе пяти видов пшениц; серию аллоплазматических видов диких пшениц на цитоплазме мягкой пшеницы; серию ЦМС линий пшеницы с ядерным rt-..омом сорта Мироновская 68 и цитоплазмами родственны* видов.
Выявление особенности взаимодействия генома и плазмона в процессе морфогенеза пыльников и при культивировании соматических тканей пшеницы могут могут быть использованы при разработке селекционно-генетических программ с исполь; ованием биотехнодо-гических ме 1Д0В.
Практический интерес для селекции пшницы на основе ЩО, представляет цитоплазма вида Т. dicoccotdeo, выделенная автором как перспективная, благодаря ее способности iraflymuxmaTS ЦМС и не оказывать отрицательных воздействий на развитее растений.
Экономическая ценность полученных результатов. Работа от
носится к фундаментальным исследованиям, что не позволяет точно
оценить сие минутную экономическую значимость полученных ре
зультатов. Однако учитывая новизну и значимость разрабатываемой
проблемы и оригинальность полученных результатов можно ожидать,
что они будут успехом использованы в селекционных программах на
прод^тивн^сть, гетерозис и.устойчивость к неблагоприятный фак
торам.
йыделенные образцы с высоким уровнем эмбриогенного потенциала при к. льтивировании пыльников щогут быть использованы в фундаментальных и прикладных исследованиях в качестве комнокен-
та или донора этого признака.
Цитоплазмы, усиливающие морфогенегические процессы in vitro представляют ценность для использования в селекционных программах, что позволит сократить затраты проведения селекции с і пользованием биотехнологических методов.
Основный положения диссертации, выносила на ааыоту. Онтогенетические приобразованйя соматических и генеративных тканей пыльника пшеницы на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях определяют его интеграцию в единую систему, развитие которой, как и морфогенез целого растения,. имеет ключевые этапы. Наиболее важные к них - конец профазы м-йоза, стадия одноядерных незакуолизированных микроспор и переход от одноядерной к двуя-доркой пыльце. В эти периоды отмечаются наиболее глубокие изменения в цитоплазме фертильных эуплазматических линий, связанные, по-видимому, с поэтапным включением ядерных генов и плаз-могенов в процессе развития пыльника и формировании пыльцы.
При замене . собственной цитоплазмы на чужеродную возникают существенные отклонения в тканевой и клеточной дифференцировке слоев стенки пыльника и спорог шой ткани, которые наиболее часто проявляются именно на этих ключевых этапах, (стерилизация - осуществляется на стадии профазы мейоза) тетрад, одноядерных невакуолизированных микроспор, одноядерных вакуолиаированных и дзуядерных микроспор; отклонения в развитии соматических тканей пыльника - на стадиях профазы мейоза, одноядерных невакуолизированных и вакуолиэированных' и двуядерных микроспор и т. п.). Характер отклонений и степень их выраженности зависят от вида донора цитоплазмы и ядерного генома аллоплазь^тической линии.
Морфогенез в культуре тканей и органов (пыльников) значительно модифиц. руется под влиянием замеиуэния собственной цитоплазмы растений пшеницы на чужеродную. Изменяется экспрессия признаков, характеризующих способность растений к индукции кал-люсов, их пролиферации, индукции эмбриогенеза и регенерации;Йар4Хт«р изменений зависит от типа чужеродной цитоплазмы и донора ядерного генома, что свидетельствует об их взаимодействии.
Характер взаимодействия генома и плазмона в контролировании признаков, характеризующих способность растений к индукции тканевых и клеточных культур, зависит от типа экспланта и стадии развития растений, на которой происходит его изоляция.
Наиболее информативными моделями в изучении эффектов взаимодействия генома и плазмона в ходе морфогенеза растений in vivo и in vitro являются аллоплаэматические линии, соадзнные путем бзккроссироЕЗИня нескольких видса пшениц путем проведения бэккрассов в реципрокных направлениях. Зти линии позволяют одновременно оценить эффекты взаимодействия генома и плазмона в морфогенезе в нескольких сочетаниях родительских форм.
Л>.чный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в , "юсертации, получены под руководством и непосредственном участии дисс .зганта в .Моратории нехромосомной наследтсвенности, а затем в группе "Органеллы и устойчивость" Института генетики и цитологии АНЕ. Е экспериментах по культивированию пыльников растений принимала участие с. н. с. Института генетики и цитологии АНБ Е. Б. Ыавришева
Апробация результатов исследований. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на Всесоюзной ст-'оэиуме "Развитие мужской генеративной сферы" (Симферо-пс ь, 1983), на V и VI Есес-юзных симпозиумах по ултрае.руктуре 'растений (Кишинев, 19S3 и Киев, 1938), Есесоиеноп-конференции "Геном растений" (Черновцы, . 1983), на П ,. III Всесоюзных конференциях по экологической генетике растений и животных ( Кишинев, 1984, 1987), V и VI съездах ЕелОГиС (Горки, 1986, 1992), на IX Есегокзном совещании по эмбриологии растений (Кишинев, 1986), на << съезде ЕОГиС в Мзскве (1957), на Всесоюзной конференции по гетерозису (Киев, 19Э8), Международной конференции по био. лгии кулътивщ...'емых клеток и биотехнологии (Новссчбрск, 1988), Республиканской конференции по электроньлг икроскспин (Минск, 1988), на XIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Звенигород, 1988), Всесоюзной конференции по частной генетике растений (Ь.:ев, 1989), Есесоетной конференции по генетике соматических клеток в культуре (Москва, 1989), Всесоюзной конференции по онтогенетике высших растений (Кишинев, 1989), на XI чи XII международных симпозиумах по эмбриологии растений (Ленинград, 1990 и Еена, 1994), Всесоюзной конференции "Даст, гения биотехнологии - агропромышленному комплексу (Черновцы. 1991), Международной конференции по биотехнологии и генетической инженерии (Киев, 1994), Республиканской конференции по генетической инженерии и биотехнологии (Минск, 1994).
Опубликовакность результатов. Результаты диссертационной
работы опубликованы в виде 2 коллективных монографий, 21 научной статьи в журналах и сборниках и 33 тезисах в материалах конференции и симпозиумов.
Структура и объем диссертации. Диссертация моложена на 257 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего ЗП1 наименование, в том числе 194 иностранных, а также 5 таблиц приложения.