Введение к работе
Актуальность проблемы Результаты многих исследований указывают на связь локализации генов в интерфазном ядре с их транскрипционной активностью Ядерная периферия и гетерохроматин считаются репрессивными доменами, а внутренняя область ядра - районом активной транскрипции Ассоциация неактивных генов с гетерохроматином была выявлена у Drosophila (Csink, Henikoff, 1996, Dernburg et al, 1996) и млекопитающих (Brown et al, 1997, Francastel et al , 1999) Репрессия генов на периферии ядра была обнаружена у дрожжей (Andrulis et al, 1998, Cockell, Gasser, 1999) и некоторых многоклеточных эукариот (Kosak et al, 2002, Zink et al, 2004, Pickersgill et al, 2006) Однако полученные недавно результаты показывают, что у дрожжей активные гены также могут занимать периферическое положение в ядре (Casolan et al, 2004, Casolan et al, 2005, Taddei et al, 2006) Отметим, что механизмы взаимодействия хроматина с белками ядерной ламины и ядерных поровых комплексов т vivo, а также механизм участия этих белков в репрессии генов у млекопитающих пока неясны Представляется интересным исследовать, могут литранскрипционно активные гены находиться на периферии ядра в ассоциации с ядерными поровыми комплексами (nuclear pore complex, NPC) у высших эукариот, таких как насекомые и млекопитающие
Поддержание стабильно активного или репрессивного состояния многих генов у Drosophila и млекопитающих осуществляется при участии белков двух антагонистических групп Polycomb (PcG) и tnthorax (trxG) (Rmgrose, Paro, 2007) Белки PcG и trxG осуществляют свои функции путем связывания с регуляторными последовательностями, называемыми Polycomc/Tnthorax-group Response Elements (PREs/TREs, или PRE-элементами) Ряд фактов позволяет предполагать, что положение PRE-элементов в интерфазном ядре и, в частности, их эктопическая конъюгация могут играть важную роль в регуляции их функции (Bantignies et al, 2003, Gnmaud et al, 2006, Vazquez et al, 2006), однако этот вопрос требует дальнейшего исследования
Цели и задачи исследования Целью исследования было изучение взаимосвязи между функциональным статусом генов и трансгенов и ихлокализацией в интерфазныхядрахОгозорл//з melanogaster и культивируемых клеток млекопитающих Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи
-
Провести сравнительный анализ ядерной локализации генов и трансгенов Drosophila в неактивном и активном состояниях
-
Изучить пространственное распределение Рс-связывающих сайтов и возможность их физического взаимодействия в интерфазных ядрах клеток личиночных тканей Drosophila
-
Сравнить расположение активного и неактивного трансгена LV-PGK в ядрахфибробластов трансгенных свиней
-
Выяснить, влияет ли отсутствие белка Трг на ядерную локализацию неактивного гена CFTR человека
Основные положения, выносимые на защиту
-
Периферия хромоцентра политенных хромосом Drosophila имеет сложную мозаичную организацию, где одновременно представлены несколько фокусов сателлита (AAGAG)n, ди- и триметилированный по лизину 4 гистон НЗ, активная форма РНК-полимеразы II и активные PRE-элементы
-
Неактивные гены Abd-B, sd и Ubx, а также Fab-7-содержащие трансгены локализуются у Drosophila на периферии интерфазного ядра
-
Транскрипционно активные Fab-7-содержащие трансгены часто локализуются на периферии хромоцентра
-
Эндогенная и трансгенная копии Fab-7 элемента располагаются независимо в ядрах клеток пяти личиночных тканей
-
Трансген LV-PGK в зависимости от функционального состояния имеет разное положение в ядрах фибробластов трансгенных свиней Sus scrofa scrofa
% Ч ^
6 Отсутствие ассоциированного с ядерным поровым комплексом белка Трг, вызванное РНК-интерференцией, приводит к изменению локализации неактивного гена CFTR в интерфазном ядре культивируемых клеток линии HeLa Научная новизна работы Впервые показано, что в интерфазных ядрах Drosophila на периферии хромоцентра одновременно представлены сателлитный повтор (AAGAG)n, ди- и триметилированный по лизину 4 гистон НЗ, активная форма РНК-полимеразы II и активные PRE-элементы Впервые проанализировано положение относительно ядерной ламины и хромоцентра генов Abd-B, sd и Ubx, а также Fab-7-содержащих трансгенов Drosophila в разных состояниях активности Впервые показано, что активные Fab-7-содержащие трансгены могут быть ассоциированы с периферией хромоцентра С помощью конфокальной микроскопии изучено взаимное расположение эндогенной и трансгенной копий Fab-7 элемента в ядрах клеток пяти личиночных тканей разных линий мух и показана их независимая локализация в ядре Взаимосвязь между активностью и положением в ядре была также установлена для трансгена LV-PGK в ядрах фибробластов трансгенных свиней Sus scrofa scrofa Впервые с помощью РНК-интерференции показано, что белок Трг, ассоциированный с NPC, необходим для локализации неактивного гена CFTR человека на периферии ядра Теоретическое и практическое значение работы Выявленная сложная архитектура периферии хромоцентра важна для понимания функциональной организации интерфазного ядра Примененные в данной работе методы изучения локализации генов в трехмерном пространстве ядра и распределения Рс-связывающих сайтов, основанные на данных конфокальной микроскопииспоследующим компьютерным анализом, могутбытьиспользованы в аналогичных экспериментах на других объектах Участие ассоциированного с NPC белка Трг в периферической локализации неактивного гена CFTR человека в сочетании с результатами других исследований позволяет предположить существование консервативного механизма взаимодействия периферических белков с хроматином Результаты, представленные в диссертационной работе, могут быть включены в план учебных курсов «Организация интерфазного ядра», «Организация хромосомы эукариот», «Эволюция геномов и кариотипов» и других, читаемых на кафедре генетики и селекции и кафедре цитологии и гистологии СПбГУ Апробация работы Результаты работы были дважды представлены в виде устных докладов на международных научных конференциях Transregio 5 (Heidelberg 2005, Munich 2006), а также в виде постеров на международных конференциях Young Scientists Meeting of the German Society for Cell Biology (Jena, Germany, 2003), Meeting of the German Society for Cell Biology (Berlin, Germany, 2004), Transregio 5 meeting (Heidelberg, Germany, 2004), Workshop on Nuclear Organization meeting (Elmau, Germany, 2004), Transregio 5 meeting (Munich, Germany, 2004), The UK Chromatin Meeting (York, England, 2005)
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из Введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы (256 источник) Иллюстрационный материал представлен 53 рисунками и 7 таблицами
