Содержание к диссертации
Введение
Физико-географическая характеристика Астраханской области 10
Экологическая обстановка Волго-Каспийского бассейна.. 16
Экологическая обстановка водотоков дельты р.Волги 16
Экологическая обстановка акватории Северного Каспия... 20
Влияние антропогенного загрязнения на биопродуктив ность дельты Волги и Каспийского моря 23
Использование гидробиологического мониторинга для оценки качества вод 28
Биологическая характеристика исследуемого объекта 34
Распространенность условно-патогенной микрофлоры в промысловых и культивируемых рыбах, а также в среде их обитания 37
Материал и методы
Методы отбора и обработки проб при эколого-микробиологическом мониторинге 56
Методы выделения и видовой идентификации условнопатогенных микроорганизмов 57
Методы определения факторов патогенности, галотоле-рантности и антибиотикорезистентности у выделенной микрофлоры и влияние на нее тяжелых металлов 60
Методы глубинного и сравнительного поверхностного посева, принятого в странах ЕС 61
Методы проведения биологической пробы на белых крысах 61
Результаты исследований
Эколого-токсикологическая оценка воды дельты Волги 62
Бактериоценоз судака в дельте Волги и влияние на него различных факторов среды 77
Сезонная динамика выделенной из воды и рыбы микрофлоры
Изучение галотолерантности выделенной микрофлоры 97
Изучение факторов патогенности выделенной микрофлоры (протеаза, лецитиназа, гемолизин, ДНКаза) 99
Изучение антибиотикорезистентности выделенной из воды и рыбы микрофлоры 103
Изучение биологических свойств некоторых условнопатогенных микроорганизмов в результате взаимодействия с солями тяжелых металлов 105
Факторы, определяющие бактериальную контаминацию внутренних органов судака естественной популяции и в условиях воспроизводства 113
Результаты биопробы на белых крысах по влиянию на их организм мыса больного дерматофибрасаркомой судака 122
Заключение 124
Выводы 130
- Экологическая обстановка водотоков дельты р.Волги
- Биологическая характеристика исследуемого объекта
- Методы определения факторов патогенности, галотоле-рантности и антибиотикорезистентности у выделенной микрофлоры и влияние на нее тяжелых металлов
- Изучение факторов патогенности выделенной микрофлоры (протеаза, лецитиназа, гемолизин, ДНКаза)
Введение к работе
ГЛАВА 1
1.1.
1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3.
1.2.4.
1.3. 1.4.
Экологическая обстановка водотоков дельты р.Волги
Наблюдения, проведенные на акватории дельты Волги показали, что по направлению к морю в водотоках усиливались продукционные процессы. Так, в нижней зоне дельты в период половодья в результате смыва биогенных веществ с затапливаемых территорий происходило увеличение концентраций органического фосфора более чем на 200% и органического азота на 62,0% по сравнению с их содержанием в вершине дельты. Помимо этого интенсивный фотосинтез в низовьях дельты способствовал биологическому связыванию минеральных форм биогенных веществ и их трансформации в органические формы (Катунин с соавт., 2002). Несмотря на значительное сокращение объемов промышленного производства и резкое уменьшение применения в сельском хозяйстве ядохимикатов в последнее десятилетие, Волго-Каспийский бассейн продолжает испытывать значительное антропогенное воздействие. Так, содержание нефтеуглеводородов в водотоках дельты р. Волги находится на уровне 3,2 ПДК. При этом некоторое увеличение данного показателя отмечали в предпаводковый период и во время летней межени. Наиболее сильное нефтяное загрязнение регистрировали в западной части дельты, в частности, на Гандуринском банке (9 ПДК), испытывающем негативное воздействие сточных вод Волго-Каспийского судоремонтного завода и судов Каспийской флотилии, находящихся в этом районе. Повышенный уровень нефтеуглеводородов наблюдали на Кировском (7 ПДК) и Главном банках (6,4 ПДК), что обусловлено усилением судоходства, перевозками нефтепродуктов и размещением в прибрежной зоне предприятий, занимающихся перекачкой нефтеуглеводо-родного сырья. В наименьшей степени нефтяное загрязнение затронуло водотоки верхней зоны дельты: реки Бузан, Ахтубу, Волгу (в городской черте), где концентрации колебались в пределах от 2,0 до 3,0 ПДК (Катунин с соавт., 2002). Суммарное содержание полиароматических углеводородов и фенолов в дельте р. Волги в последние годы относительно стабильно и в среднем составляет 0,979 и 1,6 мкг/л, соответственно. Максимальные концентрации полиаре-нов (до 1,2 мкг/л) и фенолов (до 2,6 мкг/л) фиксируются весной, что, по-видимому связано с выносом загрязняющих веществ с полыми водами, а в летне-осенний период - в связи с усилением процессов метаболизма водных растений и разложением органических остатков. Наиболее заметные изменения отмечали на р. Ахтуба и на водотоках Гандуринского и Кировского банков. Учитывая относительно невысокие значения концентраций полиароматических углеводородов и фенолов, можно полагать, что эти элементы в основном естественного происхождения.
Содержание детергентов (анионных поверхностно-активных веществ) в волжской воде в многолетнем плане характеризовалось изменчивостью. Вместе с тем, данные исследований последних пяти лет свидетельствуют о стабилизации их количества на уровне 0,020-0,045 мг/л. Наиболее заметное возрастание концентраций детергентов регистрировали на р. Ахтуба и участках Главного банка, преимущественно в августе-сентябре, что, по-видимому, связано с процессами биохимического и фотохимического превращения детергентов в продукты их трансформации, наиболее интенсивно протекающими в осенний период. Особую тревогу в последнее время вызывает увеличение пестицидного загрязнения вод дельты р. Волги и Северного Каспия как по средним, так и по максимальным показателям относительно 1990-х годов. Максимальные значения гексахлорциклогексана (0,11 мкг/л) отмечали осенью на р. Ахтуба, гепта-хлора (0,19 мкг/л) - весной на р. Ахтуба и Белинском банке, препарата ДДТ (1,73 мкг/л) — летом на Главном банке. Большое содержание ДДД, свидетельствует о хроническом загрязнении водоемов (Рылина с соавт., 2003). К широко распространенным в природных водах загрязняющим веществам относятся тяжелые металлы, которые поступают в водную среду как из техногенных, так и из природных источников. Так, содержание микроэлементов в основном варьирует в пределах, не превышающих фоновые показатели, характерные для вод дельты р. Волги, однако превышение ПДК отмечали только по цинку и меди (в среднем, в 1,7 и 5,0 раза, соответственно). Количественное соотношение тяжелых металлов можно представить следующим рядом: Zn Cu Mn Pb, Ni Co Cd. Данные различия обусловлены специфическими свойствами каждого элемента, формой их агрегатного состояния, накопления в гидробионтах и миграции этих элементов (Катунин с соавт., 2002; Рылина с соавт., 2003). В сезонном аспекте наблюдали возрастание концентраций металлов в начальный период половодья, однако пик концентраций Zn, Си, Cd, Pb, Со был отмечен в конце летней межени. Это явление может быть связано с уменьшением объемов воды, высвобождением микроэлементов в результате растворения и микробного разложения органического вещества, а также является следствием взаимодействия между придонными водами и донными отложениями, приводящими к рециркуляции, то есть процессами, способствующими эффекту вторичного загрязнения водоема. Распределение микроэлементов по исследуемым водотокам дельты р. Волги было сравнительно равномерным за исключением Главного банка, где наиболее часто регистрировали максимальные концентрации особо токсичных элементов: Zn, Си, Cd, Pb и Ni, величины которых в 1,5-2,0 раза были выше среднего уровня (Рылина с соавт., 2003). В целом, эколого-токсикологическая ситуация на водотоках дельты р. Волги в последние годы остается стабильной, о чем свидетельствует отсутствие фактов возрастания поллютантов в воде. По степени загрязнения исследуемые водотоки можно представить в следующей убывающей последовательности: Гандуринский банк Белинский, Главный банк, р. Волга Кировский банк р.Ахтуба р. Бузан (Катунин с соавт., 2001, 2002; Рылина с соавт., 2003). Однако, следует отметить, что особую опасность в эколого-рыбохозяйственном плане представляют скрытые последствия низких хронических уровней воздействия на водные экосистемы, которые отличаются относительно высокой аккумулирующей способностью и инерционностью реагирования на стрессовые воздействия (Патин, 1994). 1.2.2. Экологическая обстановка акватории Северного Каспия Поскольку исследуемый нами судак является полупроходным гидробио-нтом и нагуливается в Северном Каспии, считаем необходимым привести краткую эколого-токсикологическую характеристику данной акватории. На загрязнение Каспийского моря, особенно его Северной части, большое влияние оказывает речной сток, который является основным носителем аллох-тонных веществ и играет ведущую роль в формировании гидрологического, гидрохимического, гидробиологического режима и биологической продуктивности этой части моря. Влияние волжского стока на морскую среду и экосистему Северного Каспия носит комплексный характер.
В нем можно выделить отдельные элементы, относящиеся к водному, твердому, ионному, биогенному стоку, а также к стоку органических и загрязняющих веществ. Большое значение имеют также термический сток и вынос планктона с речными водами в море (Гранина, 1995; Коваленко, 1995; Костров, 1995; Салманов, 1999; Макарова, Курапов, 2002). Данные проведенного эколого-токсикологического обследования Северного Каспия свидетельствуют о снижении среднего уровня содержания тяжелых металлов и поверхностно-активных веществ как в воде, так и в донных отложениях. На фоне относительной стабилизации наблюдается некоторое увеличение концентраций таких токсикантов, как фенолы и хлорорганические пестициды. Сезонная и пространственная динамика содержания загрязняющих веществ на акватории Северного Каспия достаточно не однородна. Так, концентрация полиароматических углеводородов в морской воде в последние годы в среднем составляла 0,771 мкг/л, увеличиваясь к осени. Распределение фенолов отличалось мозаичностью и широким диапазоном колебаний концентраций (от 0,5 до 10 мкг/л). Их максимальный уровень регистрировали осенью; причиной этого явления могло служить дополнительное поступление фенолов за счет трансформации углеводородов. Содержание поверхностно-активных веществ характеризовалось однородностью при сравнительно невысоком их содержании -13.2 мкг/л. Распределение хлорорганических пестицидов в море отличалось крайней неоднородностью и отсутствием закономерностей как пространственных, так и сезонных. Динамика содержания микроэлементов по акватории была весьма мозаична и обусловлена как гидрологическими и гидробиологическими факторами, так и системой основных течений, а также пространственно-временной изменчивостью, определяемой гидродинамическими и геохимическими процессами (Катунин с соавт., 2001, 2002; Рылина с соавт., 2003).
Биологическая характеристика исследуемого объекта
Судак - Stizostedion lucioperca (Linne) относится к ценным промысловым рыбам пресноводного комплекса; образует полупроходную и жилую форму. В Волго-Каспийском бассейне обитает несколько стад полупроходного судака, приуроченных к опресненным участкам моря и устьям рек. В Северном Каспии он встречается почти повсеместно, за исключением глубоководной южной части Уральской Бороздины. Волжский судак обладает относительно коротким жизненным циклом, который не превышает 6 лет. Быстрый темп роста и сравнительно короткий жизненный цикл обусловливает раннее созревание, в 2 года. Основная масса его созревает в возрасте 3-4 года, на пятом году жизни практически все особи уже половозрелые. Как в Волге, так и на Урале наблюдается осенний и весенний ход судака. Он продолжается с августа по ноябрь, с пиком хода в октябре, завершаясь до ледостава. Он поднимается вверх по Волге довольно высоко и в Волго-Ахтубинской пойме, вероятно, смешивается со стадом жилого судака. Весенний нерестовый ход судака начинается вскоре после освобождения рек ото льда при температуре воды от 0,2 до 2,2С. Максимум хода отмечен во второй пятидневке апреля - первой пятидневке мая при температуре воды от 3,9 до 9,8С. Ход рыбы заканчивается в середине мая при температуре воды от 11,2 до 17,5С. Нерестится судак во всех зонах дельты, в руслах протоков и ериках, ильменях; заросших водоемов судак избегает. Нерест длится с середины апреля до начала мая при температуре воды от 6,0 до 12,0С. Нагул судака происходит в Северном Каспии, где ареал его ограничен, с одной стороны -глубинами, с другой - соленостью северокаспийских вод. Обитает он, как правило, на глубинах до 14 м и солености до 13%о. Пища судака в первый год жизни в Северном Каспии целиком состоит из ракообразных. К концу года жизни он становится типичным хищником, поедая бычков и молодь воблы (Беляева с соавт., 1989). После зарегулирования стока р. Волги условия воспроизводства судака резко ухудшились. С введением нового режима промысла в 1962 г. полностью прекратился его промысел в Северном Каспии. Однако численность этого вида рыбы оставалась относительно невысокой и резко сократилась в маловодные 70-е годы, тогда его вылов составлял 0,18 тыс.т. За последние 13 лет (с 1990 г.) вылов этой рыбы в водоемах России по данным официальной статистики колебался в пределах 0,67 - 3,62 тыс.т. В первую очередь это связано с изменением экологических факторов, улучшением водного баланса, что благотворно отразилось на условиях размножения и нагула рыб, способствуя повышению их численности (Иванов, 2000).
Установлено, что выживаемость молоди судака возрастает в годы с пониженной соленостью вод Северного Каспия и в 4-5 раз по сравнению с маловодными годами. Увеличение выноса органического вещества в Каспийское море с волжским стоком приводит к усилению процессов эвтрофикации и, как следствие, увеличению площадей с гипоксией. В связи с этим судак покидает эти районы моря и в августе-сентябре уходит в более благоприятные восточные ареалы. Такое перераспределение популяции обедняет волжский и обогащает уральский промысловый запас (Кушнаренко, 1994; Кушнаренко с соавт., 2002). В последние годы добыча судака в водах России составляла в среднем 1,1 тыс.т. в год. Основная масса судака (97,0%) добывается в осеннюю путину, поэтому в это время проводят его заготовку для рыбоводных целей. Средние про-мыслово-биологические характеристики: возраст - 2,6 лет; длина - 38,1 см; масса - 829 г (Кушнаренко с соавт., 2003). Сокращение запасов и уловов судака в Волго-Каспийском районе в конце 1990 годов, обусловленное в основном высоким неучтенным изъятием промыслового стада и неблагоприятными условиями размножения в отдельные годы, указывает на необходимость существенного расширения объемов его искусственного воспроизводства. В современных условиях оно имеет небольшие масштабы: выпуск молоди в 1998-2002 гг. колебался от 1,7 до 10 млн.шт, составив в среднем 5,1 млн.шт. Увеличение объемов выпуска молоди лимитируется проблемой заготовки производителей. Возможность весеннего отлова производителей судака потеряна из-за слабого весеннего хода рыб в дельту Волги, а осенняя заготовка сопровождается высокими отходами производителей в процессе их выдерживания и зимовки. В ходе исследований 2000-2002 гг. было установлено, что при соблюдении инструкции по отбору, заготовке и выдерживанию производителей, их функциональное состояние и воспроизводительная способность характеризовались высокими показателями: созревание 73,0-87,0%, оплодотворение икры -91,0%, выход личинок от икры 70,0-87,0%, что на 5,0-20,0% выше норматива. Несмотря на высокое качество заготовленных производителей, выживание их в зимовальных прудах было низким - 30,0-31,0%. Отход производителей за первый месяц выдерживания связан в основном с инфекционным заболеванием -сапролегниозом, гибель от которого колебалась от 9,1 до 60,4%, возрастая при повышении температуры воды. В связи с этим была проведена пролонгированная профилактика сапролегниоза различными препаратами. Полученные результаты свидетельствовали о перспективности использования «Фиолетового К» для профилактики сапролегниоза у судака в период зимовки и икринок на стадии вращающегося эмбриона. Разработка методов, снижающих потери рыб в период зимовки и эмбриогенеза, дает возможность увеличить масштабы искусственного воспроизводства судака в дельте Волги (Васильченко с соавт., 2002, 2003). Как предмет наших исследований, судак выбран не случайно. Это хищник, имеющий дегистивный контакт с водной пелагиалью, быстрее других гид-робионтов реагирует на малейшие изменения среды. В связи с этим по мнению ряда специалистов может быть объективным тест - индикатором санитарно-эпизоотического и экологического состояния водоема (Ларцева, Катунин, 1993; Кушнаренко, 1994; Иванов, 2000; Кушнаренко с соавт., 2002). 1.4. Распространенность условно-патогенной микрофлоры в промысловых и культивируемых рыбах, а также среде их обитания В последние два-три десятилетия стало известно, что для большинства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов равнообязательны две среды обитания, одну из которых они используют для паразитирования (различных животных, человека), другую - в свободноживущих фазах жизни. Именно фазовые преобразования возбудителя происходят при смене сапрофи-тических и паразитических циклов его жизнедеятельности.
Широкое применение в народнохозяйственных целях различных химиопрепаратов, использованиє в медицине и ветеринарии антибиотиков увеличивает вероятность роста мутагенности микроорганизмов, приобретение патогенных свойств у бактерий, которые ранее считались сапрофитами. Это обусловливает глубокие нарушения экологических взаимоотношений между биоценозами и объясняет хроническое течение многих инфекций как у теплокровных, так и холоднокровных животных (Беляков, Яфаев, 1989; Антон, 1993; Куликовский с соавт., 1996). Микрофлора, широко распространенная в воде, грунтах, обладая высокой ферментативной активностью, может значительно инфицировать рыбу, используя ее в качестве экологической ниши. Выявленная патогенность и комменсализм, способность длительного персистирования в различных гидробионтах свидетельствуют о высокой информативной значимости микробиологических исследований рыбы и среды ее обитания, а также необходимости мониторинговых наблюдений за изменчивостью различных заболеваний рыб (Liston, 1990; Виноградова, Пархомчук, 1991; Ganthier et.al, 1993; Литвин, Пушкарева, 1994; Novo et.al, 1994; Домарадский, 1997; Бычкова, 2002 ). Показано, что морские и речные гидробионты однозначно повторяют микробное состояние своей среды обитания (Liston, 1988; Ларцева, Катунин, 1993). Отмечено, что промысловые объекты прибрежного лова имеют большую бактериальную обсемененность, чем выловленные в открытом море (Шульгина и др., 1995). В отличие от пелагических, такая же тенденция характерна для рыб, ведущих придонный образ жизни (Ларцева, 1998). Причем сразу после вылова и засыпания рыб проницаемость кишечника возрастает, и микроорганизмы быстро мигрируют в мышечную ткань, которая имеет нейтральную или слабощелочную реакцию (рН 6,9-7,2), соответствующую оптимальному развитию многих энтеропатогенных бактерий. Большое содержание воды и питательных веществ в тканях рыб и беспозвоночных способствует быстрому размножению в них микрофлоры, в частности аэромонад, листерий и вибриофло-ры (Шульгина и др., 1995).
Методы определения факторов патогенности, галотоле-рантности и антибиотикорезистентности у выделенной микрофлоры и влияние на нее тяжелых металлов
Для изучения влияния различных концентраций тяжелых металлов на ростовую реакцию и адаптационные возможности условно-патогенной микрофлоры Волго-Каспийского региона были проведены экспериментальные работы с использованием штаммов бактерий, выделенных из речной воды дельты р. Волги: Citrobacter freundii (авирулентный); Aeromonas hydrophila (авирулент-ный) и A.hydrophila (обладающий протеолитической, гемалитической, лецити-назной и ДНКазной активностью). Численность колониеобразующих микроорганизмов определяли методом десятикратных разведений и последующим высевом аликвоты в 3-х повторно-стях на плотную питательную контрольную среду (МПА) и с добавлением сульфидов кадмия (CdS04), меди (CuS04) и цинка (ZnS04) в концентрациях 5, 10 и20мкг/л. На третьи сутки после посева проводили повторное тестирование всех испытуемых штаммов на наличие или изменение маркеров патогенности. Согласно микробиологическому Критериуму, разработанному ВОЗ для создания единой системы оценки сырья и пищевых продуктов в рамках Программы по стандартизации ФАО/ВОЗ был проведен сравнительный анализ количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) при различных методах посева, объектами исследования были мышцы и печень судака (10 экз.), выловленного в районах промысла дельты Волги в летне-осенний период 1999 г. Посев проводили двумя методами: глубинным (принятым в Российской Федерации): внесение 1 мл соответствующего разведения в стерильную чашку Петри с последующим заливанием расплавленным и остуженным до 40,0С МПА; и поверхностным (утвержденным в странах ЕС): внесение 0,1 мл разведения уже на застывший агар и растирание пробы по его поверхности стерильным шпателем. 2.5. Методы проведения биологической пробы на белых крысах Экспериментальные исследования по влиянию мяса судака, больного дерматофибросаркомой на организм теплокровных (белых крыс), проводили на базе и при участии Астраханской государственной ветеринарной лаборатории. Опыт осуществляли в двух вариантах: I - простое скармливание мясом больного судака и II - скармливание после инъекции гидрокортизона в дозе 125 мг/кг веса, приводящей к иммунодефициту. Длительность наблюдения составила 3 месяца. В качестве первого контроля использовали интактных животных, которым в рационе животный белок заменяли мясом судака. Второй контроль -введение гидрокортизона и включение в рацион мяса здорового судака.
В процессе опыта наблюдали за поведением животных, а в конце эксперимента изучали патологические изменения и гистоструктуру внутренних органов подопытных животных. Эколого-микробиологические показатели являются неотъемлемой частью биомониторинга, необходимые для оценки качества вод и экологического состояния экосистемы в целом. Кроме того, он позволяет и оценить качество воды как среду обитания гидробионтов, определить совокупный эффект комбинированного воздействия загрязняющих веществ и трофические свойства воды (Абакумов, 1992; Щетинина, 2003; Курочкина, 2004). Полученные результаты проведенного анализа по общему количеству бактериопланктона и гетеротрофной микрофлоры в водотоках Волго-Ахтубинской поймы и рукавов дельты Волги показали, что развитие гидромикрофлоры носит строго закономерный сезонный характер (рис. 3.3; 3.4; 3.5; 3.6) и согласуется с результатами исследований других регионов страны (Михайличенко с соавт., 1995; Добровольская с соавт., 2001). Так, весенние пики количественных показателей развития микроорганизмов были в первую очередь связаны с увеличением органического вещества и вовлечением его в биологический круговорот гидроэкосистемы, а также с большим поступлением в водоем аллохтонной микрофлоры в паводковый период, в мае. Это в значительной степени отразилось на численности бактериопланктона, когда максимум его развития в среднем составлял (10,7 ± 0,73) на р. Волга; (5,2 ± 0,5) - на р. Ахтуба; (7,8 ± 0,2) - на р. Бузан; (4,8 ± 0,4) и (3,3 ± 0,3) млн.кл/мл - на Главном и Гандуринском банках, соответственно (рис. 3.3; 3.4). Следует отметить, что одним из основных внутриводоемных факторов, регулирующих развитие и распределение бактерий в водных объектах, может быть массовая вегетация водорослей и развитие зоопланктона. Показано, что количество бактерий взаимосвязано с их обилием и физиологическим состоянием. При этом, в начальные периоды их развития возможна обратная зависи мость численности бактерий от биомассы фито- и зоопланктона (Горбунов, 1976; Романенко с соавт., 1990; Мучкина, Грабовенко, 1998). В пользу этого свидетельствуют наши данные об отсутствии ярко выраженного весеннего пика количества гетеротрофных бактерий в водотоках дельты Волги. Так, максимальная численность сапрофитной микрофлоры была в начале вегетационного периода, т. е. в апреле и варьировала от (3,3 ± 0,5)- р. Бузан до (8,2 ± 0,8) тыс.кл/мл - р. Волга (рис. 3.5, 3.6). В летний период по результатам проведенных исследований зарегистрировано значительное снижение количественных показателей в развитии микрофлоры, что было статистически достоверно (Р 0,05). Так, численность бактери-опланктона была минимальной в июле-августе и в среднем составляла (2,3 ± 0,6) млн.кл/мл, а гетеротрофные бактерии были на уровне (3,1 ± 0,8) тыс.кл/мл в июне-июле, что обусловлено высокой активностью планктонных организмов, снижением запасов органического вещества и недостатком кислорода в летнюю межень. Далее, с августа по октябрь зарегистрирован второй пик численности микроорганизмов. При этом, максимально выраженным был резкий подъем количества гетеротрофной микрофлоры (рис. 3.5, 3.6), связанный с обогащением водной среды метаболитами гидробионтов и продуктами их постлетальной минерализации (отмиранием фито-, зоопланктона и разложением водной растительности). В зависимости от гидрологических и гидрохимических особенностей исследуемых водотоков максимум численности сапрофитов приходился на сентябрь-октябрь и достигал в среднем (16,1+3,1) - на р. Волга; (37,4+6,9) - на р.Ахтуба и (23,3 + 3,4) тыс. кл/мл -на р. Бузан, что было статистически достоверно (Р 0,05).
На Главном и Гандуринском банках количество белокразрушающей микрофлоры было максимальным в августе и составляло (2,9 ± 0,2) и (4,6±1,1) тыс.кл/мл, соответственно по этим районам и было статистически достоверным (Р 0,05) (рис. 3.5; 3.6). Наряду с этим, мы отмечали некоторое увеличение и общей численности бактериопланктона - до (3,1 + 0,2) на р. Волга; (5,7 ± 0,3) -на р. Ахтуба; (4,3 ±0,4) - на р. Бузан; (1,9 ± 0,2) - на Главном и (3,6 ± 1,2) млн.кл/мл на Гандуринском банках (рис. 3.3; 3.4). Таким образом, сравнительный анализ биопрофилей бактериопланктона дельты Волги позволил выявить их своеобразие, обусловленное температурным режимом воды (рис. 3.7). Затянувшаяся весна и дождливое лето 2003 г. определили более плавную динамику развития планктонных и бентосных организмов (Курочкина, 2004), обогативших водотоки дельты Волги органическим веществом, что, в свою очередь, привело к более плавному развитию микрофлоры, без ярко выраженных пиков (рис. 3.5; 3.6). По всей вероятности, он отражает результат приспособления бактериальных популяций к специфическим условиям исследуемой экониши. Во всех случаях экологическая детерминация выраженности их пиков и спадов была достаточно значимой (Р 0,01). Ахтубинской пойме позволили дифференцировать степень загрязнения данных водотоков согласно эколого-санитарной классификации качества поверхностных вод суши и индекса (Романенко, Оксиюк с соавт., 1993). Полученные данные приведены в табл. 3.2. Они показали, что общее количество бактерий, т. е. число сапрофитной микрофлоры и их соотношение позволяют охарактеризовать состояние исследуемой экосистемы по шкале экологических модификаций (Абакумов, 1992). Физические данные, приведенные в табл. 3.2, 3.3, показали, что весной и летом все анализируемые водотоки Волго-Ахтубинской поймы и дельты р. Волги относились к а—Р мезосапробной зоне, т. е. от достаточно чистой до умеренно загрязненной, а в начале осени к а - мезосапробной зоне, т. е. сильно загрязненной, что было обусловлено высокими значениями численности белок разрушающей гетеротрофной микрофлоры и благоприятными условиями для ее развития. Анализируя пространственное распределение микрофлоры, фактические материалы которого приведены в этой же таблице, необходимо отметить, что весенний пик численности бактериопланктона был наиболее ярко выражен на реках Волга и Бузан, а в дельте - на Главном банке, где проходит основной сток паводковых вод (Р 0,05), в результате чего усиливалась биогенная нагрузка на эту акваторию Нижней Волги.
Изучение факторов патогенности выделенной микрофлоры (протеаза, лецитиназа, гемолизин, ДНКаза)
Антропогенное воздействие на окружающую среду приводит к изменению условий существования бактерий, что, в свою очередь, включает их адаптационные механизмы. Именно они приводят к активизации факторов, способствующих их циркуляции в объектах окружающей среды, и сопровождаются процессами изменчивости микробов. Одним из следствий этого процесса может быть повышение их патогенности (Бухарин, 1999). Известно, что бактериальная популяция обладает гетерогенностью, являющейся одним из важнейших условий существования вида. В связи с этим факторы патогенности выполняют двойную функцию, обеспечивая выживание паразита как в организме хозяина, так и во внешней среде. Причем, микроорганизмы при переходе к паразитическому образу жизни приобретают ряд преимуществ, в сравнении с сапрофиче-скими фазами своего существования, где они окружены различными конкурентами, хищниками и т.д. При этом каждому патогенному виду микробов присущ свойственный только ему набор факторов патогенносте, обеспечивающих выживаемость возбудителя в макроорганизме, его размножение и распространение в тканях, а также способность к активному биологическому воздействию на функции макроорганизма (Бухарин, 1999; Головина с соавт., 2003). Следовательно, изучение патогенности свойств бактерий, играющих роль адаптивных факторов - неотъемлемая часть микробиологических исследований. В пользу этого свидетельствуют цифровые данные анализа факторов патогенности у выделенной микрофлоры (рис. 315). Они наглядно демонстрируют то, что изолированная нами гидромикрофлора обладала более высокими значениями протеолитической и лецитиназной активностью (в 1,4 и 1,2 раза соответственно), чем выделенная от рыб. Известно, что с помощью ферментов протеиназ и лецитиназ бактерии преодолевают тканевые барьеры, расщепляют белковые молекулы и при интенсивном размножении в рыбе определяют ее автолиз, порчу и различные патологические процессы (Кагпор, 1982; цит.по Лар-цева, 2003). Гемолитическая активность (феномен Канагава), т. е. способность микроорганизмов разрушать человеческие эритроциты - свидетельство эпидемиологической опасности бактерий для человека.
В отличие от протеазы и лецитиназы, преобладающих у водных штаммов микроорганизмов, гемолитической активностью обладали почти на одном уровне штаммы, выделенные как из воды, так и из рыбы (рис. 315), соответственно в 20,1 ± 0,7 и 18,8 ± 0,8% случаев. Следовательно, независимо от проис хождения культуры, микрофлора, персистирующая в водной экосистеме дельты Волги, имеет определенную эпидемиологическую опасность для человека. Особую привлекательность как маркер патогенности имеет ДНКазная активность, поскольку подтверждена ее близкая корреляция со способностью вызывать патологические процессы у рыб и человека (Юхименко, 1988; Camahan et al., 1989; Cercenado, 1989; Бойко, 1998; цит. по Ларцева, 2003). Как свидетельствуют данные рис. 315, ДНКаза аэромонад была достаточно высокой, независимо от экотипической принадлежности выделенных штаммов. Следовательно, миграция аэромонад по схеме вода-рыба-вода осуществляется по пищевым звеньям или в результате тесного контакта биотических и абиотических составляющих водной экосистемы. По-видимому, благодаря именно ДНКазе аэромонады способны эффективно адаптироваться к организму рыб, вступая с ними в различные симбиотические отношения. Результаты анализа сезонной динамики маркеров патогенности (рис. 3.16) показали ее динамичное нарастание у рыбных штаммов выделенных нами микроорганизмов. При этом гидромикрофлора посезонно практически не изменяла показателей своей патогенности. Это согласуется с принципом экологической детерминации факторов патогенности по О.В.Бухарину (1999) и служит не только инструментом сохранения видов, но и обеспечивает устойчивость их систем. Ее необходимость проявляется прежде всего при контакте с популяцией хозяина, в данном случае с рыбой. Цифровые значения рис. 3.16. свидетельствуют, что протеолитическая активность всей микрофлоры, выделенной от судака, возрастала от весны к осени в 1,3; лецитиназная, гемолитическая и ДНКазная - в 1,2 раза. Здесь наглядно прослеживается связь нарастания факторов патогенности с улучшением физиологического статуса рыб, связанным с их летним и осенним нагулом. В соответствии с этим микроорганизмам необходимо «строить свой баланс вирулентности», необходимый им для выживания в накормленном здоровом организме рыб. В то же время высокая, патогенность бактерий в летне-осенний сезон обусловливает их эпидемиологическую значимость для людей. Не лишне повторить, что пик всех кишечных инфекций в нашем регионе приходится на позднее лето и раннюю осень, а аэромонадные диареи в это время превосходят по своей значимости даже шигеллезы (Погорелова с соавт., 1995; Бойко, 1998; цит. по Ларцева, 2003). кую ДНКазу (от 1,0 до 4,0 мм) с июня до середины октября. Доминантами патогенных свойств у энтеробактерий были лецитиназа, за исключением протеев, которые лидировали по протеазе. У псевдомонад и флавобактерий в основном регистрировалась протеаза. Бациллы и грибы имели более чем в 50,0% случаев протеазу и лецитиназу. Таким образом, учет набора факторов патогенности и (или) персистенции позволяет отнести конкретный штамм микроорганизма к способности образовывать паразитарные системы, т. е. экологическое благополучие водоемов может тестироваться микробиологическими методами. 3.6. Изучение антибиотикорезистентности выделенной из воды и рыбы микрофлоры Изучение антибиотикорезистентности микрофлоры является логическим завершением бактериологических исследований в области биологии, ветеринарии, медицины. Антибиотикорезистентность приобретается микроорганизмами в качестве защитного фактора от изменений окружающей среды, обусловленных техногенным прессом (Мойсеенко, 1994). В последнее десятилетие отмечается повышение резистентности различных патогенных бактерий к антибиотикам. Одной из причин этого может быть использование одних и тех же препаратов для лечения людей и животных (Асаг et.al., 2001).
При этом устойчивые штаммы проявляются в большом количестве и с возрастающей частотой, что свидетельствует об увеличении потребления или использования антибиотиков. Поскольку новые антибиотики стали редкими, сложилась ситуация уязвимости - в любой момент может появиться патогенно-эпидемическая бактерия, обладающая множественной антибиотикорезистентностью. При этом независимо от механизмов возникновения устойчивости, комменсальная флора является промежуточным звеном и играет основную роль в распространении резистентных патогенных видов. Последствия этого очень велики, так как селекция резистентных бактерий среди комменсальной, сапрофитной и условно-патогенной межуточным звеном и играет основную роль в распространении резистентных патогенных видов. Последствия этого очень велики, так как селекция резистентных бактерий среди комменсальной, сапрофитной и условно-патогенной флоры встречается особенно часто и происходит при каждом соприкосновении или приеме антибиотиков (Andremot, 2002). В литературе приведены данные о высокой резистентности к антибиотикам бактерий, выделенных из рыбы и замороженных морских продуктов (Raloff, 2001). Результаты наших исследований показали, что микрофлора, обсеменяющая судака и воду, обладала множественной антибиотикорезистентностью (рис. 3.17). При этом независимо от сезона года и исследованного объекта мы регистрировали близкие показатели. Отмечено, что выделенные микроорганизмы проявляли максимальную чувствительность к левомицетину; затем - по убывающей - к тетрациклину, стрептомицину, фурадонину и ампицилину. Минимальная чувствительность у всех бактерий была зарегистрирована к бензилпе-нициллину, т. е. он уже не «работает» как антибиотик. Аналогичные данные получены при исследовании других рыб (жереха) в речной, бычков в морской экосистемах и молоди осетровых в условиях аквакультуры (данные отчетов лаборатории научной диагностики болезней рыб КаспНИРХ). Тяжелые металлы являются главной компонентой в загрязнении Волго-Каспийского бассейна.
